สารตัวกลาง (intermediate) C4a-hydroperoxyflavin เป็นสารที่พบในปฏิกิริยา oxidative half-reaction ของเอนไซม์ในกลุ่ม flavin-dependent monooxygenase ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่มี FAD (flavin adenine dinucleotide) เป็น cofactor สาร intermediate ดังกล่าวมีความสำคัญต่อการเติม oxygen atom ให้กับสาร aromatic substrate ในขั้นปฏิกิริยา hydroxylation โดยอาศัย oxygen จากอากาศ ในลักษณะเดียวกันกับเอนไซม์ในกลุ่ม flavoprotein oxidase ซึ่งมี flavin เป็น cofactor เป็นที่เชื่อกันมานานว่าเอนไซม์ในกลุ่ม flavoprotein oxidase แยกจากกลุ่มของเอนไซม์ flavin-dependent monooxygenase ได้ เนื่องจากไม่พบการเกิด intermediate C4a-hydroperoxyflavin ในปฏิกิริยาของกลุ่ม flavoprotein oxidase (รูปที่ 1, หมายเลข 2) แต่จากการศึกษากลไกปฏิกิริยา oxidative half-reaction ของเอนไซม์ pyranose 2-oxidase พบว่าเป็นเอนไซม์ในกลุ่ม flavoprotein oxidase ตัวแรกที่พบการเกิด intermediate C4a-hydroperoxyflavin (Sucharitakul, J., Prongjit, M., Haltrich, D., and Chaiyen P. (2008) Biochemistry 47, 8485-8490) pyranose 2-oxidase เป็นเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาการเกิด oxidation ของ D-glucose ที่ C2 ใน pyranose ring ให้เป็น 2-keto-D-glucose โดย electron จาก D-glucose จะถูก transfer ไปยัง FAD cofactor เรียกปฏิกิริยานี้ว่า reductive half-reaction ในขั้นถัดมา electron จาก FAD cofactor จากถูก transfer ไปยัง oxygen และเปลี่ยนเป็น H2O2 (รูปที่ 2) การศึกษานี้ได้ใช้ solvent kinetic isotope effect (SKIE) เพื่อศึกษากลไกของปฏิกิริยา oxidative half-reaction โดยการทำปฏิกิริยาดังกล่าวใน D2O (deuteroxide) แทนที่ H2O ผลที่ได้พบว่า D2O ไม่มีผลต่อ rate constant ในขั้นการเกิด C4a-hydroperoxyflavin intermediate แต่มีผลต่อเฉพาะในขั้นการสลายตัว(decay) ของ intermediate เท่านั้น และเป็นขั้นตอนเดียวกันกับการเกิด elimination ของ hydroperoxy group ของ C4a-hydroperoxyflavin intermediate ไปเป็น H2O2 ผลของ D2O ดังกล่าวทำให้ rate constant ในการสลาย intermediate ช้าลง เมื่อเทียบกับ rate constant ของการสลาย intermediate ใน H2O เป็น 2.8  0.2 เท่า เมื่อศึกษาโดยการใช้ proton inventory พบว่า rate constant ของการสลาย intermediate ลดลงตามสัดส่วนของ deuterium mole atom fraction (D/H) ในลักษณะ linear dependent บ่งชี้ว่า จำนวน proton นั้นมีเพียงหนึ่ง proton เท่านั้นที่เกี่ยวข้องในการเกิด elimination ของ hydroperoxy group ของ C4a-hydroperoxyflavin intermediate ไปเป็น H2O2 นอกจากนี้การใช้ deuterium labeled ที่ atom ของ nitrogen ที่ N5 ของ flavin ring ใน enzyme โดยใช้ double-mixing stopped-flow spectrophotometer ด้วยการผสม oxidized enzyme กับ 2-deuterated-D-glucose ในขั้นแรก (first mixing) ซึ่งมีผลทำให้ deuterium atom ที่อยู่ที่ C2-D ของ 2-deuterated-D-glucose ไปอยู่ที่ตำแหน่ง N5 ของ flavin ring เกิดเป็น N5-D ผ่านทาง hydride transfer ของปฏิกิริยา reductive half-reaction จากนั้นในขั้นที่สอง (second mixing) reduced enzyme ซึ่งมี N5-D อยู่ที่ flavin ring จะถูก reoxidized โดยการผสมกับ oxygen buffer เพื่อทำให้เกิด C4a-hydroperoxyflavin intermediate ผลปรากฏว่า isotope effect rate constant ในการสลาย intermediate ช้าลงให้ผลเหมือนกับปฏิกิริยาใน D2O ทำให้สรุปได้ว่ากระบวนการเกิด elimination ของ hydroperoxy group ของ C4a-hydroperoxyflavin intermediate ไปเป็น H2O2 เริ่มเกิดจากการเกิด deprotonation ของ hydrogen atom ที่ N5-H (หรือ deprotonation ที่ N5) และ เป็น proton เดียวกันกับที่ทำให้เกิด elimination ไปเป็น H2O2 C4a-hydroperoxy-flavin is commonly found in the reactions of flavin-dependent monooxygenases, in which it plays a key role as an intermediate that incorporates an oxygen atom into substrates. Although its role in monooxygenase reactions has been well established, only recently has evidence for its involvement in the reactions of flavoprotein oxidases been reported. Previous studies of pyranose 2-oxidase (P2O), an enzyme catalyzing the oxidation of pyranoses using oxygen as an electron acceptor to generate oxidized sugars and hydrogen peroxide (H2O2), have shown that C4a-hydroperoxy-flavin forms in P2O reactions before it eliminates H2O2 as a product [Sucharitakul, J., Prongjit, M., Haltrich, D., and Chaiyen, P. (2008) Biochemistry 47, 8485-8490]. In this report, the solvent kinetic isotope effects (SKIE) on the reaction of reduced P2O with oxygen were investigated using transient kinetics. Our results showed that D2O has a negligible effect on the formation of C4a-hydroperoxy-flavin. The ensuing step of H2O2 elimination from C4a-hydroperoxy-flavin was shown to be modulated by an SKIE of 2.8  0.2, and a proton inventory analysis of this step indicates a linear plot. These data suggest that a single-proton transfer process causes SKIE at the H2O2 elimination step. Double and single-mixing stopped-flow experiments performed in H2O buffer revealed that reduced flavin specifically labeled with deuterium at the flavin N5-position generated kinetic isotope effects similar to those found with experiments performed with the enzyme pre-equilibrated in D2O buffer. This suggests that the proton at the flavin N5 position is responsible for the SKIE and is the proton-in-flight that is transferred during the transition state. The mechanism of H2O2 elimination from C4a-hydroperoxy-flavin is consistent with a single proton transfer from the flavin N5 to the peroxide leaving group, possibly via the formation of an intra-molecular hydrogen bridge.