Pyranose จาก Basidiomycetes, Trametes multicolor เป็นเอนไซม์ซึ่งมีส่วนของ FAD (Flavin adenine dinucleotide) ทำหน้าที่เป็น cofactor เร่งปฏิกิริยาการเกิด oxidation ที่ตำแหน่ง C-2 ของ D-glucose ให้สารผลิตภัณฑ์เป็น 2-D-ketoglucose และ H2O2 เอนไซม์นี้มีส่วนของ FAD ซึ่งยึดกับสาย polypeptide ด้วยพันธะ covalent (covalent linkage) ที่ตำแหน่งของกรดอะมิโน Histidine (H167) ในการศึกษานี้จึงนำส่วนของพันธะ covalent ออกด้วยการเปลี่ยนกรดอะมิโนจาก Histidine ที่ตำแหน่งดังกล่าวเป็น alanine (H167A) เพื่อศึกษาบทบาทของพันธะ covalent ในการควบคุมการเกิดปฏิกิริยา จากผลการเปลี่ยนแปลงพันธะ covalent (deflavinylation cffent) พบว่าความสามารถในการรับ electron ของเอนไซม์ลดลง โดยวัดจากค่า redox potential ซึ่งค่า redox potential ของ mutant enzyme มีค่าเท่ากับ -1502 mV เมื่อเทียบกับ wild type เอนไซม์ มีค่าเท่ากับ -1502 mV ผลดังกล่าวสอดคล้องกับผลของการศึกษาในระดับ pre-steady kinetics โดยใช้ stopped-flow spectrophotometer พบว่า rate constant ในการเกิดปฏิกิริยา reduction ของ mutant เอนไซม์โดยใช้ D-glucose ลดลงเท่ากับ 0.280.007 s-1 เมื่อเทียบกับ wild-type enzyme (141 s-1) อย่างไรก็ตามในปฏิกิริยา oxidative reaction เมื่อreduced enzyme ทำปฏิกิริยากับ oxygen พบว่ากลไกและ rate constant ในแต่ละขั้นของปฏิกิริยาไม่แตกต่างกันกับ wild-type enzyme ผลจากการศึกษาดังกล่าวชี้ให้เห็นถึงความสำคัญของพันธะ convent ระหว่างเอนไซม์กับ cofactor ในการควบคุมค่า redox potential ของเอนไซม์ในการเกิดปฏิกิริยา reduction Pyranose oxidase from basidiomycete, Trametes multicolor mainly catalyzes oxidation of D-glucose at the C2-position, resulting 2-keto-D-glucose and hydrogen peroxide as products [1]. This enzyme is a flavoprotein containing a covalently bound FAD through histidyl linkage (H167) [2]. In this study, the wild-type enzyme was mutated at the flavinylation residue to be alanine (H167A). De-flavinylation affects the enzyme thermodynamic and kinetic properties. The redox potential of mutant was found to be -150±2 mV, compared to the value of the wild-type of 105±1 mV. Stopped-flow studies of the reductive half-reaction showed that the oxidized enzyme rapidly bound to D-glucose to form Michaelis-Menten complex with a Kd of 37.5±2 mM following isomerization. No isotope effect was detected at these binding steps when 2-d-D glucose (deuterated glucose) was used. After the binding, the enzyme was reduced with a rate of 0.28±0.07 s-1. This rate of reduction is significantly lower than the value of the wild-type (14±1 s-1). Oxidative half-reaction of the enzyme shows biphasic traces. The first step is a bimolecular reaction to form a flavin intermediate with a rate constant of 4x104 M-1s-1 and the second step is a decay of intermediate correlated to the oxidation of flavin with a rate constant of 16.7±2 s-1 at oxygen saturation. Steady-state kinetics provided the catalytic constant (kcat) to be 0.18±0.01 s-1 indicating that the reductive half-reaction is a rate-limiting step.