บีตากลูโคซิเดสและเอกโซกลูแคนเนสมีบทบาทสำคัญในพืชอันได้แก่กระบวนการสลายและสร้างผนังเซลล์ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงการโอกาสที่จะใช้เอนไซม์ในการแปลงพลังงานชีวมวล การที่จะนำเอนไซม์เหล่านี้มาใช้ให้ดีที่สุด ต้องเข้าใจวิธีการจับของเอนไซม์กับ oligosaccharides รวมทั้งตัวกำหนดความจำเพาะต่อการย่อยสับสเตรต ที่กระตุ้นให้เอนไซม์ปลดปล่อยบีตากลูโคสหรือน้ำตาลโมเลกุลเดี่ยวที่คล้ายกันจาก oligosaccharides ในการวิจัยนี้จึงได้ทำการผลิตโปรตีนสายผสม ศึกษาหน้าที่และโครงสร้างของเอนไซม์ตระกูล glycoside hydrolase family 1 (GH1) และ 3 (GH3) สำหรับเอนไซม์ตระกูล GH1 เริ่มจากการศึกษาโครงสร้างพื้นฐาน ในการจับและย่อยสลาย glucooligosaccharide ด้วยการวิเคราะห์โครงสร้างของผลึกเอนไซม์ของเอนไซม์ Os3BGlu7 ของข้าว โครงสร้างของเอนไซม์ในสภาวะเปลี่ยนขณะที่จับกับ 2-fluoroglucoside ด้วยพันธะโควาเลนท์ และโครงสร้างของเอนไซม์กลายพันธุ์ตรงตำแหน่งหมู่เร่ง acid/base คือ E176Q ซึ่งยังสามารถเร่งปฏิกิริยาได้บ้าง ทั้งในสภาพเอนไซม์อิสระและที่จับกับ 2-fluoroglucoside celltetraose cellopentaose และ laminaribiose จากโครงสร้างของ cellotetraose และ cellopentaose แสดงให้เห็นว่าแม้ nonreducing glucosyl residue จะจับอย่างสมบูรณ์ด้วยการสร้างพันธะโดยตรงกับโปรตีน แต่หน่วยกลูโคสอื่นๆ จับกับกรดอะมิโนชนิด aromatic ด้วยพันธะไฮโดรเจนโดยมีน้ำเป็นตัวกลาง เนื่องจากเอนไซม์กลายพันธุ์ Os3BGlu7 E176Q ยังคงย่อย p-nitrophenyl-β-D-glucoside ในสภาวะที่มีโมเลกุลขนาดเล็กที่มีประจุลบ ทำให้สามารถคำนวณค่าพลังงานยึดเหนี่ยวของโมเลกุลกลูโคสแต่ละหน่วยกับเอนไซม์ จากค่าคงที่การยับยั้งแบบแข่งขันของ cellooligosaccharides การเปลี่ยนกรดอะมิโนตรงร่องของตำแหน่งเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ได้พิสูจน์ว่ากรดอะมิโนเหล่านี้มีส่วนร่วมในการจับ oligosaccharide อีกด้วย เพื่อที่จะทราบถึงตัวกำหนดความจำเพาะต่อการย่อยสับสเตรตระหว่างบีตากลูโคซิเดสและบีตาแมนโนซิเดสที่มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกัน จึงได้นำเอนไซม์ตระกูล GH1 ที่อยู่บนแผนภูมิความสัมพันธ์ในเชิงวิวัฒนาการใกล้เคียงกัน มาศึกษาเปรียบเทียบ ได้แก่ บีตากลูโคซิเดส Os3BGlu7 และบีตาแมนโนซิเดส rHvBII ของบาร์เล่ย์ และได้ผลิตเอนไซม์ข้าวที่อยู่ในกลุ่มนี้อีกสองชนิดคือ Os3BGlu8 และ Os7BGlu26 พบว่า Os3BGlu8 ที่มีความคล้ายคลึงกับ Os3BGlu7 มากที่สุดสามารถย่อย β-glucosides ได้ดี ในขณะที่ Os7BGlu26 ที่มีความคล้ายคลึงกับ HvExoI มากที่สุดพบว่าสามารถย่อย β-mannosides ได้ดีเป็นไปตามที่คาดหมายไว้ อย่างไรก็ตามการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนเพียงหนึ่งตำแหน่งที่อยู่ใกล้กับตำแหน่งเร่งปฏิกิริยาไม่สามารถเปลี่ยนบีตากลูโคซิเดสให้เป็นบีตาแมนโนซิเดสหรือเปลี่ยนบีตาแมนโนซิเดสให้เป็นบีตากลูโคซิเดสแม้ว่าจะมีการเปลี่ยนแปลงอัตราส่วนของการทำงานบ้าง จากความคิดที่ว่าสภาพเปลี่ยนของ mannosides และ glucosides มีรูปร่างที่ไม่เหมือนกันและมีวิธีการจัดเปลี่ยนโครงสร้างที่แตกต่างกันด้วย จึงได้มีการเปรียบเทียบการจับของ glucoside thioglucoside mannoside และ thiomannoside กับ Os3BGlu7 และ HvBII โดยการศึกษาการยับยั้ง ความแตกต่างของ saturation transfer ด้วย NMR และการคำนวณ QM/MM พบว่า thioglycosides แสดงลักษณะที่แตกต่างจาก O-linked glycosides จึงได้แบบจำลองปฏิสัมพันธ์ที่ไม่ดี ส่วน glycosides ทุกชนิดสามารถจับที่ตำแหน่งเร่งปฏิกิริยาด้วยโครงสร้างที่หลากหลาย การวิเคราะห์โครงสร้างของแมนโนซิเดส Os7BGlu26 และกลูโคซิเดส Os3BGlu7 ที่จับเชิงซ้อนกับ mannosides ยังคงอยู่ระหว่างการดำเนินงานเพื่อทำให้เกิดความเข้าใจมากยิ่งขึ้น GH3 เป็นอีกหนึ่งแบบจำลองของการทำงานของบีตากลูโคซิเดสที่ย่อยทั้ง oligosaccharides และ polysaccharides ได้มีการใช้เอนไซม์ ExoI ของบาร์เล่ย์เป็นโครงสร้างแม่แบบสำหรับเอนไซม์ในตระกูลนี้ อย่างไรก็ตามเอนไซม์นี้ไม่ได้มีการผลิตมาจากระบบโปรตีนสายผสมมาก่อน งานวิจัยนี้จึงทำการพัฒนาระบบการผลิตโปรตีนสายผสม วิธีการแยกโปรตีนให้บริสุทธิ์และตกผลึกสำหรับเอนไซม์สายผสม ExoI (rHvExoI) ทำให้สามารถศึกษาผลจากการเปลี่ยนชนิดของกรดอะมิโนแต่ละตัวในตำแหน่งเร่งปฏิกิริยา ต่อการทำงานและระดับการทำงานของเอนไซม์ ถึงขั้นตอนนี้พบว่าการเปลี่ยนชนิดของกรดอะมิโนเกือบทุกตัวที่ล้อมรอบตำแหน่งเร่งปฏิกิริยานั้นทำให้การทำงานของเอนไซม์มีระดับต่ำลง แต่การทำงานของ E220A และ W434A มีมากพอที่จะศึกษาคุณสมบัติและเรียนรู้เกี่ยวกับหน้าที่ที่แน่นอนของกรดอะมิโนสองชนิดนี้ได้ Beta-glucosidases and exoglucanases play many important roles in plants including cell wall recycling, which points to their potential use in biomass conversion. In order to make the best use of these enzymes, we need to understand the way they bind to oligosaccharides, as well as the determinants of substrate specificity, which drive them to release a -linked glucose or similar monosaccharides from oligosaccharides. In this study, we addressed these issues by recombinant expression, functional and structural studies of glycoside hydrolase family 1 (GH1) and 3 (GH3) enzymes. For the GH1 enzymes, we first addressed the structural basis for glucooligosaccharide binding and hydrolysis by solving the X-ray crystal structures of rice Os3BGlu7, its covalent intermediate with 2-fluoroglucoside, and its semiactive catalytic acid/base mutant, E176Q, alone and in complexes with 2-fluoroglucoside, cellotetraose, cellopentaose, and laminaribiose. The cellotetraose and cellopentaose structures showed that, although the nonreducing glucosyl residue is completely bounded by direct bonds to the protein, all the other residues are primarily bound by water-mediated hydrogen bonds and stacking on aromatic residues. Since the Os3BGlu7 E176Q mutant remained active on p-nitrophenyl--D-glucoside in the presence of small nucleophiles, the energies of binding of the different glucosyl residues could also be estimated from the competitive inhibition constants of the cellooligosaccharides. Mutations of the residues along the active-site cleft also verified their involvement in oligosaccharide binding. In order to address the determinants of substrate specificity between closely related -glucosidases and -mannosidases, the GH1 phylogenetic cluster including Os3BGlu7 -glucosidase and barley HvBII -mannosidase was studied by comparison of these enzymes and expression of two more rice isoenzymes from this cluster. Os3BGlu8, which is most similar to Os3BGlu7 was found to prefer -glucosides, while Os7BGlu26, which is most similar to HvBII was found to prefer -mannosides, as might be expected. No mutation of a single residue near the active site was able to convert a -glucosidase to a -mannosidase or a -mannosidase to a -glucosidase, although some shifted the ratio of activities in that direction. Since mannosides and glucosides are thought to transverse different shaped transition states and undergo different conformational pathways to do so, with binding of glucoside, thioglucoside, mannoside, and thiomannoside to Os3BGlu7 and HvBII were compared by inhibition studies, saturation transfer difference NMR, and QM/MM calculations. It was found that the thioglycosides behaved differently from the O-linked glycosides, making them poor models for such interactions, and all glycosides could to bind to the active sites in multiple conformations. Solving of the structure of Os7BGlu26 -mannosidase and Os3BGlu7 -glucosidase in complexes with mannosides is underway to gain more insight into this issue. GH3 serves as another model of -glucosidase activity, acting on both oligosaccharides and polysaccharides and barley ExoI has been a structural model for this family, but was not previously expressed in recombinant systems. Our development of a recombinant expression system, and purification and crystallization methods for the recombinant ExoI enzyme, rHvExoI, allowed us to investigate the effects of mutating each active site amino acid residue at both the functional and structural level. So far, we showed that mutation of nearly every amino acid surrounding the active site gave negligible to low levels of activity, but two, E220A and W434A had enough activity to characterize and learn about their specific functions. Together, these studies helped train seven graduate students and produced seven international publications, in addition to basic knowledge for future applications.