ได้ทำการสร้าง B. pseudomallei genomic libraries ใน E.coli โดยใช้ enzyme Xho I มาตัด chromosomal DNA แล้ว clone เข้าไปใน XL-1 Blue E.coli โดยใช้ pKS- เป็น vector ผลปรากฎว่า ให้ efficiency = 2x106 cells/ug DNA (Transformed โดยใช้วิธีของ Hanahan.D.) แต่เนื่องจากผล การ check Blue/white พบว่า colony ส่วนใหญ่เป็น Blue colony ซึ่งแสดงถึงว่า colony ดังกล่าวไม่ มี insert จึงได้ทำการ construct ใหม่โดยเปลี่ยน Enzyme เป็น Sac II ซึ่งสามารถตัด chromosome ของ B.pseudomallei ได้เป็นขนาดต่าง ๆ ตั้งแต่ 1 kb-4 kb ซึ่งเหมาะแก่การ clone จึงได้ใช้ Sac II แทน และเมื่อทำการสร้าง libraries ได้พบว่าให้ efficiency = 5x106 cells/ug DNA โดยมี white = 2x105 cells/ug DNA เมื่อเอา libraries นี้มา screen ด้วย rabbit anti-crude B.pseudomallei, anti- CF (culture-filtrate Ag) และ anti-PCE (partially purified cell extract antigen) และ anti-SOM (Somatic crude antigen) โดยใช้ swine anti-rabit-HRP และ alpha-4-chloro-naphtol เป็น secondary antibody และเป็น substrate ตามลำดับ หลังจาก screen ไปทั้งสิ้น 6,100 white colonies พบว่ามี positive clones อยู่ 20 clones แต่เมื่อนำ clones ดังกล่าวมาเลี้ยงเพื่อให้ expressed products โดย induce ด้วย IPIG แล้วจึงนำ protein ที่ได้มาวิเคราะห์ด้วยวิธี SDS- PAGE และ Western blot พบว่ามีเพียง clone เดียว (clone # 35) ให้ชื่อเรียกภายหลังว่า pKKU- SA35 เท่านั้นที่สร้างโปรตีนขนาดประมาณ 36.5 kDa ที่ทำปฏิกิริยากับ rabbit anti B.pseudomallei นอกจากนี้ผู้วิจัยยังได้ทำการสร้าง genomic libraries ใน E. coli โดยใช้ enzyme Pst I มาตัด chromosomal DNA แล้ว clones เข้าไปใน XL-1 Blue E. coli โดยใช้ pKS- เป็น Vector ผลปรากฎ ว่าเมื่อทำการ screen หา recombinant (white colonies) ได้ 2,000 colonies พบว่ามี positive clones อยู่เพียง 2 clones เท่านั้นที่เมื่อนำมาวิเคราะห์ด้วย SDS-PAGE และ Western blot กับ rabbit anti B. pseudomallei แล้วให้ผล positive ให้ชื่อเรียก clones ดังกล่าวว่าเป็น pKKU-P18 และ pKKU-P3 จากการศึกษา characterize ของ clone ทั้งสาม โดยใช้ซีรัมจากผู้ป่วยโรคเมลิออยโด สิส และโรคติดเชื้อแบคทีเรียชนิดอื่น ๆ พบว่า clone pKKU-SA35 มีศักยภาพที่ดีที่สุดที่จะนำไปใช้ ในการสร้าง specific antigen สำหรับการวินิจฉัยโรคเมลิออยโดสิส ได้ทำการวิเคราะห์แอนติเจนที่ ผลิตจาก positive clones ทั้งสามด้วยวิธี Western blot โดยใช้ซีรั่มจากผู้ป่วยเมลิออยโดสิส แล้วนำ ผลที่ได้ไปเทียบกับแอนติเจนที่เตรียมจาก culture-filtrated ของเชื้อแล้วนำมาทดสอบด้วยวิธี Dot immunoassay พบว่าแอนติเจนที่ผลิตจาก clone pKKU-SA35 ให้ sensitivity ในการ detection ของ แอนติบอดีในผู้ป่วย septicenic melioidosis ได้ดีกว่า clone อื่น และดีกว่าแอนติเจนที่เตรียมจาก CF และใช้วิธี dot immunoassay และแอนติเจนที่ผลิตจาก clone pKKU-SA35 จะให้ specificity สูงกว่า clone อื่นและ CF Ag เช่นกัน (วิธี dot immunoassay ได้ตีพิมพ์แล้วในวารสาร Southeast Asian J. Trop.Med.Pub. ในปี 1996; 26: 329 - 334) ผู้วิจัยได้ศึกษาวิเคราะห์ clone ทั้งสาม โดย การทำ restriction map ของ insert ทั้งสาม clones และวิธี RFLP พบว่า clone pKKU-SA35 และ pKKU-P3 มี insert ที่มี map ใกล้เคียงกันมาก จึงได้ทำการวิเคราะห์เฉพาะ clone pKKU-SA35 และ pKKU-P18 ต่อไปโดยการนำ insert DNA ไปหาลำดับเบสด้วยวิธี Dideoxy chain termination ทั้ง วิธี manual และ automate และได้ทราบลำดับเบสของ clone ทั้งสองไปบางส่วนแล้ว โดยทราบ ประมาณ clone ละ 1,000 b. นอกจากนี้ยังได้ทำการ subclone ทั้งสองโดยนำ insert ของ clone ทั้ง สองไป subclone ลงไปในพาหะใหม่ (Vector) ที่มีชื่อเรียกว่า pGEX -5X -3 เพื่อต้องการให้สามารถ แยกให้แอนติเจนที่ผลิตได้ให้บริสุทธิ์ โดย Vecfor pGEX -5X -3 นี้ จะมี tac promotor และมี GST (Glutathione -S-transferase) โดยแอนติเจนที่เราผลิตได้จะเป็น fusion protein อยู่กับ GST แล้ว จึงนำ fusion protein นี้แยกออกจากโปรตีนอื่น ๆ ของ E. coli ด้วยวิธี Affinity chromatography ใน การทดลองครั้งนี้สามารถ subclone เอาชิ้น insert ของ pKKU-SA35 เข้าสู่ pGEX-5X-3 ได้ แต่ โปรตีนที่ผลิตได้พบว่าเป็น inclusion body (precipetate) ไม่เป็น soluble จึงไม่สามารถที่จะแยกให้ บริสุทธิ์ได้ด้วยวิธี Affinity chromatography เพื่อให้การนำเอาแอนติเจนที่ผลิตได้จาก clone pKKU-SA35 ไปใช้อย่างมีประสิทธิภาพ ตลอดจนโรคเมลิออยโดสิสเป็นโรคที่พบมากในภาคตะวัน ออกเฉียงเหนือที่มีการระบาดของโรคหนอนพยาธิ์ชุกชุม ผู้วิจัยจึงได้นำแอนติเจนที่ผลิตจาก clone นี้ ไปทดสอบกับ serum ผู้ป่วยจำนวน 24 รายที่เป็นโรคหนอน พยาธิ์ชนิดต่างๆ เช่น Opisthorchiasis, Hookworm, Strongiloides, Taenia, Ecchinococcosis และโรคติดเชื้อ minute fluke, พบว่า แอนติเจนจาก clone pKKU-SA35 ที่มีขนาดโมเลกุล 36.5 kDa ไม่มีปฏิกิริยาข้ามพวกกับ serum จากผู้ป่วยโรคหนอนพยาธิ์ดังกล่าวเลย ดังนั้น แอนติเจนดังกล่าวน่าจะมีศักยภาพที่ดีในการนำไปใช้ เป็น immunodiagnostic antigen ต่อไป เมื่อนำข้อมูลลำดับเบสของ clone pKKU-SA35 มาวิเคราะห์เทียบกับ genes อื่น ๆ ใน Gen Bank โดยอาศัย program blast x โดย translate both strands ของ pKKU-SA35 sequence ใน 6 reading frames พบว่ามีความใกล้ เคียงกับ gene (วิเคราะห์ดูจากจุลชีพที่จัดอยู่ในกลุ่มที่ไกล้เคียง กัน) ของ Xanthomonas campestris ที่ควบคุมการสร้าง UDP-glucose dehydrogenase และ gene ของ Pseudomonas aeruginosa ที่ควบคุมการสร้าง glycerol kinase นอกจากนั้นแล้ว ผู้วิจัยยังได้พยายามจะผลิตแอนติเจนดังกล่าวให้มีปริมาณมากขึ้น โดยการ เปลี่ยน Vector จาก pKS, pGEX มาเป็น pTrcHis ซึ่งมี Vector ทั้ง 3 reading frames เป็น A,B,C. ใช้ Trc promotor ซึ่ง protein ที่ได้จะเป็น fusion protein กับ series ของ six histidine residue ซึ่ง สามารถใช้ในการ purification ได้ และมี enterokinase cleavage recognition sequence อยู่ตรง ระหว่าง histidine กับ fusion protein จะทำให้สามารถ cleavage เอา fusion protein ออกได้หลัง จากการ purification แต่เนื่องจาก Vector ดังกล่าวไม่มี multiple cloning sites ที่เป็น Sac II ซึ่ง เป็น enzyme ที่ใช้ในการ clone ของ gene ใน pKKU-SA35 จึงทำให้การ subclone เป็นไปได้ ลำบาก ผู้วิจัยได้ purify insert จาก clone pKKU-SA35 ด้วย Sac II แล้วทำให้เป็น blunt end โดย ใช้ T4 DNA polymerase หลังจากนั้น นำชิ้น insert ไป subclone เข้า pTrcHis ที่ตัดด้วย Xho I ที่ ทำให้เป็น blunt end เช่นกันด้วย Klenow polymerase โดยทำทั้ง 3 Vector คือ A,B,C ผลปรากฎ ว่าได้ clone ที่มี insert แต่ไม่มีการ experssion ซึ่งทำให้ไม่สามารถ subclone และ purify product ได้ ขณะนี้ผู้วิจัยกำลังแก้ปัญหาดังกล่าวอยู่ด้วย และใช้ adaptar ในการ clone แทน