กากเมล็ดสบู่ดำเป็นผลพลอยได้ที่เหลือจากกระบวนการสกัดน้ำมันสบู่ดำ กากเมล็ดสบู่ ดำมีโปรตีนสูงและมีสารพิษ phorbol esters รวมทั้งสารต้านคุณค่าทางโภชนาการซึ่งเป็น ข้อจำกัดต่อการนำกากเมล็ดสบู่ดำและโปรตีนในกากเมล็ดสบู่ดำไปใช้ประโยชน์ การกำจัด สารพิษในกากเมล็ดสบู่ดำเป็นงานวิจัยที่จำเป็นสำหรับการประยุกต์ใช้กากเมล็ดสบู่ดำ ดังนั้น งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อกำจัดสารพิษในกากเมล็ดสบู่ดำโดยวิธีทางชีวภาพด้วยแบคทีเรียที่ ปลอดภัย ได้แก่ B. subtilis, B. licheniformis และ L. plantarum และเพื่อศึกษากิจกรรม ออกฤทธิ์ทางชีวภาพของโปรตีนไฮโดรไลเซทจากกากเมล็ดสบู่ดำปลอดสารพิษ โดยศึกษา กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ กิจกรรมยับยั้งเอนไซม์ก่อภาวะความดันโลหิตสูงและกิจกรรมยับยั้ง การเติบโตของแบคทีเรียก่อโรค การกำจัดสารพิษในกากเมล็ดสบู่ดำด้วยแบคทีเรียโดยใช้วิธีการหมักแบบอาหารแข็ง (solid-state fermentation) และแบบอาหารเหลว (submerged fermentation) การหมักแบบ อาหารแข็งทำโดยใช้กากเมล็ดสบู่ดำ 10 กรัม ปรับความชื้นที่ 70 เปอร์เซ็นต์ และหมักด้วย แบคทีเรียเป็นเวลา 7 วัน สำหรับการหมักแบบอาหารเหลว ใช้กากเมล็ดสบู่ดำ 10 กรัมและเติม น้ำกลั่น 100 มล. หมักด้วยแบคทีเรียโดยการเขย่าฟลาสก์เป็นเวลา 5 วัน การหมักทั้งสองแบบ ทำที่สภาวะการหมักที่เหมาะสมของแบคทีเรียแต่ละชนิด ทั้งนี้ทำการเก็บตัวอย่างวันที่ 0 และ ตัวอย่างวันสุดท้ายหลังจากการหมักสิ้นสุด เพื่อวิเคราะห์การเติบโตของแบคทีเรีย ค่า pH ปริมาณสารพิษ phorbol esters และสารต้านคุณค่าทางโภชนาการ ผลการศึกษาการลดสารพิษ ในกากเมล็ดสบู่ดำด้วยแบคทีเรีย พบว่าการหมักกากเมล็ดสบู่ดำด้วย B. licheniformis แบบ อาหารเหลวมีประสิทธิภาพสูงสุดในการกำจัดสารพิษและสารต้านคุณค่าทางโภชนาการในกาก เมล็ดสบู่ดำโดยสามารถลดสารพิษ phorbol esters, phytic acid และ trypsin inhibitor ได้ 62 เปอร์เซ็นต์, 42 เปอร์เซ็นต์ และ 75 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ทั้งนี้การหมักกากเมล็ดสบู่ดำทั้งแบบ อาหารเหลวและอาหารแข็งด้วยแบคทีเรียทุกชนิดไม่มีผลต่อการกำจัด lectin และ saponin นอกจากนี้ผลการศึกษาพบว่าการลดลงของสารพิษดังกล่าวสอดคล้องกับปริมาณเอนไซม์ esterase, phytase และ protease ที่แบคทีเรียผลิตขึ้นระหว่างการหมัก จะเห็นว่าผลของการ หมักกากเมล็ดสบู่ดำด้วย B. licheniformis นอกจากช่วยให้สารพิษและสารต้านคุณค่าทาง โภชนาการลดลงแล้ว โปรตีนในกากเมล็ดสบู่ดำหมักยังเพิ่มสูงขึ้น ดังนั้นกากเมล็ดสบู่ดำหมัก อาจนำไปประยุกต์ใช้เป็นส่วนผสมของอาหารสัตว์ได้ โปรตีนถูกแยกจากกากเมล็ดสบู่ดำโดยเริ่มจากการกำจัดสารพิษ phorbol esters ใน กากเมล็ดสบู่ดำด้วยเอทานอล 90 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นละลายโปรตีนออกจากกากเมล็ดสบู่ดำที่ ปราศจากสารพิษด้วยการปรับค่า pH เท่ากับ 12 ที่อุณหภูมิ 30oC กวน 100 รอบ/นาที นาน 3 ชั่วโมง จากนั้นตกตะกอนโปรตีนจากสารละลายโปรตีนที่ค่า pH เท่ากับ 4 ซึ่งเป็นจุด isoelectric point ของโปรตีนในกากเมล็ดสบู่ดำ จากนั้นโปรตีนถูกย่อยด้วยเอนไซม์โปรติเอส 4 ชนิด ได้แก่ Neutrase, trypsin, papain และ pepsin ที่สภาวะการย่อยที่เหมาะสมเป็นเวลา 6 ชั่วโมง ผล การศึกษาพบว่าโปรตีนไฮโดรไลเซทที่ย่อยด้วยเอนไซม์ Neutrase เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แสดง กิจกรรมการต้านสารอนุมูลอิสระ 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•) สูงสุด โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 3.31 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และโปรตีนไฮโดรไลเซทที่ย่อยด้วยเอนไซม์ pepsin ที่เวลา 2 ชั่วโมง แสดงกิจกรรมยับยั้งเอนไซม์ก่อภาวะความดันโลหิตสูงสูงสุด โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 0.76 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร อย่างไรก็ตามโปรตีนไฮโดรไลเซททุกตัวอย่างไม่พบกิจกรรมยับยั้งการเติบโต ของแบคทีเรีย นอกจากนี้สารต้านอนุมูลอิสระในโปรตีนไฮโดรไลเซทถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วย เทคนิคโครมาโตกราฟฟี ได้แก่ gel filtration, ion exchange chromatography, reverse phase HPLC และstrong cation exchange chromatography พร้อมกับศึกษาคุณสมบัติของสาร ดังกล่าวด้วย mass spectrometry, amino acid analyser และ nuclear magnetic resonance spectroscopy พบว่าสารต้านอนุมูลอิสระมีองค์ประกอบของกรดไขมัน อนุพันธ์ของกรดไขมัน และเพปไทด์ ดังนั้นกากเมล็ดสบู่ดำเป็นแหล่งโปรตีนที่ประยุกต์ใช้ในการผลิตโปรตีนไฮโดร- ไลเซทที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพและโปรตีนไฮโดรไลเซทดังกล่าวอาจนำไปประยุกต์ใช้ใน อุตสาหกรรมอาหารหรือยาและเภสัชกรรมทดแทนสารสังเคราะห์ทางเคมี Jatropha curcas seed cake is a by-product generated from oil extraction of its seed. Although it contains a high amount of protein, it has phorbol esters and antinutritional factors such as phytate, trypsin inhibitor, lectin and saponin. It cannot be applied directly in the food or animal feed industries. The investigations were aimed at detoxifying the toxic and anti-nutritional compounds in J. curcas seed cake by fermentation with Generally Recognized As Safe (GRAS) strains; Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Lactobacillus plantarum, with solid-state and submerged fermentations and investigating biological activities; antioxidative activity, angiotensin-Iconverting enzyme, ACE, inhibitory activity and antimicrobial activity, of protein hydrolysate obtained by enzymatic hydrolysis of J. curcas seed cake protein. Solid-state fermentation was done on 10 g of seed cake with a moisture content of 70% for 7 days, while submerged fermentation was carried out on 10 g of seed cake in 100 ml distilled water for 5 days. The fermentations were incubated at the optimum condition of each strain. After fermentation, bacterial growth, pH, toxic and antinutritional compounds were determined. Results showed that B. licheniformis with submerged fermentation were the most effective method to degrade toxic and antinutritional compounds in the seed cake. After fermentation, phorbol esters, phytate and trypsin inhibitor were reduced by 62%, 42% and 75%, respectively, while lectin and saponin could not be eliminated by both strains. The reduction of phorbol esters, phytate and trypsin inhibitor was directly related to esterase, phytase and protease activities, respectively, produced by the bacterium. J. curcas seed cake could be mainly detoxified by bacterial fermentation and the high-protein fermented seed cake could be potentially applied to animal feed. After toxins were removed from the seed cake, proteins in the detoxified seed cake were then solubilized by an alkaline solution and precipitated at their isoelectric point (pH 4). The isolated proteins were hydrolyzed by proteases; trypsin, pepsin, Neutrase and papain. Hydrolysate fractions were determined for their antimicrobial activity against Bacillus cereus TISTR687, Staphylococcus aureus TISTR1466, Salmonella Typhimurium TISTR292 and Escherichia coli TISTR780, antioxidative activity and angiotensin-I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity. Protein hydrolysates obtained by Neutrase hydrolysis at 1 h and by pepsin hydrolysis at 2 h strongly expressed the highest anti-oxidant activity against 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•) radical and anti-ACE activity, respectively, with the IC50 of 3.31 mg/ml and 0.76 mg/ml, respectively. However, no antimicrobial activity was found in any protein hydrolysates. After a purification series of protein hydrolysate by liquid chromatography, a chemical acted as DPPH radical inhibitors in the hydrolysate was likely found to be a mixture of fatty acids, fatty acid derivatives and a trace amount of peptides characterized by mass spectrometry, amino acid analyser and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Therefore, J. curcas seed cake could be a protein source applied to produce bioactive protein hydrolysate. The J. curcas protein hydrolysate, as a natural bioactive product, would be applied in the food and pharmaceutical industries.