วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2552

พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอต (PHA) เป็นพอลิเอสเทอร์ชีวภาพที่สังเคราะห์โดยจุลินทรีย์หลายชนิด Ralstonia eutropha สายพันธุ์ A-04 เป็นจุลินทรีย์สายพันธุ์ใหม่ซึ่งคัดแยกได้จากดินในประเทศไทย และมีรายงานว่าสามารถผลิตอนุพันธ์ของ PHA ได้หลายชนิด งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อศึกษาลำดับนิวคลีโอไทด์ โคลนและแสดงออกยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตของจุลินทรีย์สายพันธุ์ที่คัดแยกนี้ใน Escherichia coli เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการผลิต PHA ให้สูงขึ้น ผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอต โดยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ร่วมกับการใช้ชุดสำเร็จ GenomeWalker[superscript TM] Universal Kit พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตจากจุลินทรีย์สายพันธุ์นี้ ประกอบด้วย 3 กรอบการเปิดอ่าน (ORF) ซึ่งมีขนาด 1,770 1,182 และ 741 คู่เบส ตามลำดับ โดยมีผลิตภัณฑ์ที่มีความเหมือนกับ R. eutropha สายพันธุ์ H16 สูงถึง 99% และมีความสัมพันธ์ใกล้เคียงกับเอนไซม์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตซินเทส (phaC) เบต้าคีโตไทโอเลส (phaA) และอะซิโตอะเซทิลโคเอรีดักเทส (phaB) ของ R. eutropha สายพันธ์ H16 ตามลำดับ จากนั้นโคลนยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตและแสดงออกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ araBAD ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยอะราบิโนส (pBAD/TOPO[superscript ®] ThioFusion[superscript TM] เวกเตอร์) ศึกษาการผลิต PHB ของรีคอมบิแนนท์ E. coli ในระดับขวดเขย่าโดยการแปรผันชนิดของอาหาร ความเข้มข้นของสารเหนี่ยวนำ (L-อะราบิโนส) และขนาดของหัวเชื้อเริ่มต้น ผลวิจัยแสดงว่าการเลี้ยงโดยใช้ขนาดของหัวเชื้อเริ่มต้น ผลวิจัยแสดงว่าการเลี้ยงโดยใช้ขนาดของหัวเชื้อเริ่มต้นน้อยและอาหาร LB ที่มีคาร์บินิซิลิน 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร และเสริมด้วย 1% L-อะราบิโนสให้น้ำหนักเซลล์แห้ง 6.11 กรัมต่อลิตรและปริมาณ PHB 5.7 กรัมต่อลิตร ใน 24 ชั่วโมง ซึ่งบ่งชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกของยีนเหล่านี้ใน E. coli เป็นผลให้ได้ระดับ PHB ในสัดส่วนที่สูงเท่ากับ 93.3% (น้ำหนัก/น้ำหนัก) ที่ 24 ชั่วโมง เมื่อเปรียบเทียบกับจุลินทรีย์ต้นแบบ R. eutropha สายพันธุ์ A-04 ที่สะสม PHB สัดส่วน เท่ากับ 78% (น้ำหนัก/น้ำหนัก) ที่ 60 ชั่วโมง ดังนั้นความสามารถของรีคอมบิแนนท์ E. coli ในการแสดงออกกรอบการอ่าน phaCAB นำไปสู่การผลิต PHB ที่มีคุณลักษณะที่เหนือกว่าทั้งในด้านการเจริญและการผลิต PHB ที่รวดเร็ว