วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2552

วิทยานิพนธ์นี้มีจุดประสงค์เพื่อคัดแยกยีนไดออกซิจีเนสที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายสารประกอบพอลิ ไซคลิกแอโรมาติกไฮโดรคาร์บอน (Polycyclic Aromatic Hydrocarbon, PAHs) จากเมตาจีโนมดิน โดยสร้าง ระบบนิเวศจำลองดินที่เติมฟีแนนทรีนและ/หรืออะซีแนพธีนให้มีความเข้มข้นสุดท้ายในดินเป็น 300 ppm เพื่อชัก นำให้แบคทีเรียดั้งเดิมในดินสามารถปรับตัวและมีความสามารถในการย่อยสลาย PAHs บ่มเป็นเวลา 6 สัปดาห์ และเก็บตัวอย่างทุก 2 สัปดาห์เพื่อวิเคราะห์การลดลงของปริมาณ PAHs โดยวิธีแก๊สโครมาโตกราฟี และสกัดดี เอ็นเอสำหรับตรวจติดตามการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างประชาคมแบคทีเรียด้วยเทคนิค PCR-DGGE และคัดแยก ยีนไดออกซิจีเนสโดยวิธี PCR และสร้างห้องสมุดเมตาจีโนมดิน ผลการทดลองพบว่าฟีแนนทรีนถูกย่อยสลายจน หมดใน 4 สัปดาห์ ส่วนอะซีแนพธีนถูกย่อยสลายจนเหลือ 24.52 เปอร์เซ็นต์ ของความเข้มข้นเริ่มต้นในสัปดาห์ที่ 6 และเมื่อเติมฟีแนนทรีนและ/หรืออะซีแนพธีนเป็นแหล่งคาร์บอนพบการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างประชาคม แบคทีเรียอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเปรียบเทียบกับแบคทีเรียดั้งเดิมในดิน ผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์สามารถ ระบุชนิดของแบคทีเรียบางชนิดที่มีบทบบาทต่อการย่อยสลายอะซีแนพธีนและ/หรือฟีแนนทรีน ได้แก่ Bacillus sp. และ Delftia sp นอกจากนี้ยังพบแบคทีเรียเด่นที่คาดว่าเป็นกลุ่มที่ไม่สามารถเพาะเลี้ยงหรือเพาะเลี้ยงได้ยาก ในห้องปฏิบัติการ สำหรับการคัดกรองยีนประมวลรหัสไดออกซิจีเนสที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสารประกอบ PAHs โดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ 10 คู่ ที่จำเพาะต่อยีนดังนี้ ndo phn arh bph nah ado และ PAH-RHDα ซึ่ง จำเพาะต่อยีนจากแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ และใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนประมวลรหัสเอกซ์ตราได ออลไดออกซิจีเนสบางกลุ่ม 2 คู่ ที่จำเพาะต่อยีน bph พบผลิตภัณฑ์ PCR เมื่อใช้ไพรเมอร์คู่ GPF และ GPR และ คู่ไพรเมอร์ NMR331f และ NMR1134r ซึ่งจำเพาะต่อแอลฟาริงไฮดรอกซิเลททิงไดออกซิจีเนสของแบคทีเรียแกรม บวก เมื่อสร้างห้องสมุดยีนพบรีคอมบิแนนท์จากผลิตภัณฑ์ PCR และวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์พบ 12 โคลนที่ น่าสนใจ โดยมีผลิตภัณฑ์จากโคลนที่มีเปอร์เซ็นต์ความเหมือนต่ำกว่า 97 เปอร์เซ็นต์ จำนวน 9 โคลน และพบ 2 โคลนที่มีแนวโน้มเป็นยีนไดออกซิจีเนสชนิดใหม่ที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายอะซีแนพธีนและฟีแนนทรีน โดย ผลิตภัณฑ์จากยีนมีเปอร์เซ็นต์ความเหมือนเพียง 66 และ 41 เปอร์เซ็นต์กับโปรตีนส่วน Rieske (2Fe-2S) ของ หน่วยย่อยแอลฟาริงไฮดรอกซิเลททิงไดออกซิจีเนสของ Comamonas testosteroni สายพันธุ์ KF-1 [ZP_03542810.1] และ Mycobacterium vanbaalenii สายพันธุ์ PYR-1 [YP_951396.1] ที่เกี่ยวข้องต่อการย่อย สลาย PAHs โดยไม่ต้องผ่านการคัดแยกเชื้อในห้องปฏิบัติการได้ จากผลการทดลองที่ได้แสดงให้ว่าการใช้เมตา จีโนมดินและเทคนิคทางชีวโมเลกุลทำให้สามารถคัดแยกยีนไดออกซิจีเนสที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลาย PAHs ที่ น่าสนใจและทราบข้อมูลยีนดังกล่าวในสิ่งแวดล้อมเพิ่มขึ้น ข้อมูลยีนที่ศึกษาได้นี้มีประโยชน์ในการออกแบบใช้ เทคนิคทางชีวโมเลกุลสำหรับการบำบัด PAHs ต่อไปได้