ไซยาโนแบคทีเรีย เป็นจุลชีพที่สังเคราะห์แสงให้ออกซิเจน สามารถเติบโตได้ในอาหารเลี้ยงเชื้อราคาถูก ได้ใช้เป็นเจ้าบ้านสาหรับการแสดงออกของยีน heterologous ต่างๆ อย่างไรก็ดี ระดับการแสดงออกของยีน heterologous ในไซยาโนแบคทีเรีย มีระดับต่ากว่าใน E.coli โครงการวิจัยนี้มีเป้าหมายที่จะพัฒนา enhancer/ โปรโมเตอร์ (promoter) และบริเวณเริ่มถอดรหัส (translation initiation region) ให้สามารถทางานแข็งขันในไซยาโนแบคทีเรียSynechococcus PCC7942 ได้ทาการตรวจสอบการทางานของโปรโมเตอร์ของSynechococcus outer membrane protein A (SomA) ซึ่งเป็นโปรตีนที่พบมากที่สุดในที่หุ้มเซลล์ ผลการทดลองพบว่า การทางานของโปรโมเตอร์ somA อยู่ระดับต่ากว่าโปรโมเตอร์tRNApro (PtRNA) ได้มีการประเมินการใช้ green fluorescent protein (GFP) เป็นโปรตีนรายงานใน Synechococcus ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า ระดับฟลูออเรสเซนต์ของเซลล์ที่มีcytoplasmic GFP สูงกว่า เซลล์ที่มี periplasmic GFP ถึง 6 เท่า ดังนั้นจึงใช้ cytoplasmic GFP เป็นตัวรายงาน สภาวะที่เหมาะสมที่สุดในการแสดงออกของ GFP คือการเลี้ยง Synechococcusหนึ่งวันภายใต้แสงที่มีความเข้ม 4000-4500 lux เพื่อตรวจหา enhancer/ โปรโมเตอร์ ที่ทางานแข็งขันจึงได้ตรวจกรองหา GFP activity สูงจาก Synechococcus ที่มี synthetic libraries pLLและ pUL ซึ่งมี LysR binding sequences และ UP element/ LysR sequences (ตามลาดับ) อยู่ด้านหน้าของ PtRNA พบว่าโคลนที่มี pUP-UP140, pLL-172, pLL-209 และ pUL-146 มีค่า GFPactivity เป็น 1.56, 2.70, 2.37, 3.40 และ 3.15 เท่า (ตามลาดับ) สูงกว่าของ control (pKTGFP)จากการวิเคราะห์ลาดับเบสพบว่า pUP-UP140 มี UP element จานวน 3 ชุด ส่วน pLL-172, pLL-209 และ pUL-146 นั้นพบว่าส่วนของ transcription-translation terminator ที่อยู่ด้านหน้าของthe regulatory sequences หลุดหายไป ดังนั้น ค่า GFP activities ที่สูงขึ้นนั้นอาจเนื่องมาจาก read-through transcripts เพื่อตรวจหาบริเวณเริ่มถอดรหัสที่เหมาะสมที่สุด จึงไดัตรวจกรองหาค่า GFP activity สูงจาก Synechococcus ที่มี synthetic Shine-Dalgarno (SD)/non-SD sequence libraries ซึ่งมีส่วนของ randomized decanucleotide อยู่ด้านหน้าของยีน gfp พร้อมทั้งได้ตรวจหาระดับของ gfp mRNA โดยวิธี real-time PCR แล้ววิเคราะห์ประสิทธิภาพการถอดรหัส (translation efficiency) ประสิทธิภาพการถอดรหัสของลาดับเบสSD-like AGGAGAAUGA, AAUGGAAAUA และ AAUUGGAUUU สูงกว่าของ control(GGUGGU) อยู่ 2.38, 3.96 และ 4.89 เท่าสูง (ตามลาดับ) แสดงให้เห็นว่าลาดับเบส SD-like มีประสิทธิภาพการถอดรหัสสูงอย่างไรก็ดี ประสิทธิภาพการถอดรหัสของลาดับเบส non-SDAUGUCAACUU ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสาคัญจาก control ประสิทธิภาพการถอดรหัสของลาดับเบส non-SD UUCAAUAUUU, AUUUACCUCC และ CCAAUCUAC จาก E. coli ต่ากว่าcontrol อย่างชัดเจน ดังนั้นผลการทดลองบ่งชี้ว่า ลาดับเบส non-SD สามารถทาหน้าที่เริ่มถอดรหัสใน Synechococcus แต่มีประสิทธิภาพต่ากว่าลาดับเบส SD-like ประสิทธิภาพการถอดรหัสของลาดับเบส consensus-SD AAGGAGGU, AGGAGGU, AAAGGAGG และAGGAGG สูงกว่าของ control อยู่ 12.24, 10.52, 6.36 และ 3.77 เท่า (ตามลาดับ) ดังนั้น ลาดับเบส consensus-SD มีประสิทธิภาพการถอดรหัสสูงกว่าลาดับเบส SD-like และลาดับเบสAAGGAGGU มีความเหมาะสมที่สุดสาหรับการเริ่มถอดรหัสใน Synechococcus สาหรับtranslation enhancer นั้น การมี BoxA ของ E. coli rrnB และ pyrimidine-rich enhancer ที่อยู่ด้านหน้าของบริเวณเริ่มถอดรหัส ไม่สามารถเสริมแต่กลับลดประสิทธิภาพการถอดรหัส ดังนั้น translation enhancer จาก E. coli ไม่สามารถทางานได้ใน Synechococcus ได้ตรวจสอบบริเวณที่ทาหน้าที่ของเบสควบคุม (regulatory sequence) ของ rrnA จากSynechococcus โดยวิธี deletion analysis พบว่าเมื่อให้บริเวณที่ทาหน้าที่ของลาดับเบสควบคุมของ rrnA อยู่ด้านหน้าของลาดับเบส consensus-SD จะให้ GFP activity สูงกว่า control ถึง 23.97 เท่า ได้สารวจการทางานของโปรโมเตอร์ σ70 (Psig70) ของ E. col ใน Synechococcus ซึ่งอยู่ด้านหน้าของลาดับเบส consensus-SD ผลการทดลองพบว่า GFP activity ของ Psig70 สูงกว่า control 6.17 เท่า เพื่อสร้างลาดับเบสควบคุมที่สามารถทางานในระดับที่สูงเกินกว่าที่พบตามธรรมชาติในไซยาโนแบคทีเรีย จึงได้สร้างพลาสมิดที่มีการผสมของ tandem enhancer/ promoter และลำดับเบส consensus-SD ผลการทดลองพบว่า GFP activity ของ Synechococcus ที่มีพลาสมิด tandem promoters PrnnA -PrnnA (pRRSC), Psig70- PrnnA (pS70-RSC) และ Psig70- PrnnAPrnnA(pS70-2RSC) สูงกว่าของ control ถึง 32.33, 36.66 และ 35.88 เท่า(ตามลาดับ) เมื่อนาโปรตีนทั้งหมดที่สกัดจาก Synechococcus ที่มีพลาสมิด pS70-2RSC และ pS70-RSC มาวิเคราะห์โดยวิธี SDS-PAGE แล้วย้อมด้วย Comassie brilliant blue พบว่าสามารถมองเห็นแถบโปรตีน GFP เท่าที่คณะวิจัยโครงการนี้ทราบ รายงานนี้เป็นรายงานแรกที่แสดงให้เห็นว่าสามารถควบคุมให้การแสดงออกของโปรตีน heterologous ใน Synechococcus สูงมากพอที่จะตรวจสอบได้ด้วย SDS-PAGE ที่ย้อมด้วย Comassie brilliant blue ดังนั้น คณะวิจัยโครงการนี้ได้ประสบความสาเร็จในการสร้างลาดับเบสควบคุม ที่สามารถทางานในระดับที่สูงเกินกว่าที่พบตามธรรมชาติในไซยาโนแบคทีเรีย Cyanobacteria, oxygenic photosynthetic prokaryotes, have simple growth requirements and inexpensive to maintain. They have been used as hosts to express several heterologous genes. However, the level of heterologous gene expression in cyanobacteria is low when compared with that in E. coli. This project is aimed to develop highly active enhancer/ promoter and translation initiation region including translation initiator and translation enhancer in cyanobacterium Synechococcus PCC7942. The promoter of Synechococcus outer membrane protein A (SomA), one of the most abundant proteins of the cyanobacterial total envelope, was investigated. Results indicated that the activity of somA promoter was dramatically lower than that of tRNApro promoter (PtRNA).The use of green fluorescent protein (GFP) as a reporter in Synechococcus was evaluated. Results showed that the fluorescence intensity of cells with cytoplasmic GFP was approximately 6-fold higher than that of cells with periplasmic GFP. Therefore, cytoplasmic GFP was used as a reporter. The optimal conditions for GFP expression in Synechococcus were 1-day cultures grown under light intensity of 4000-4500 lux. For highly active enhancer/ promoter, Synechococcus harboring synthetic libraries pLL and pUL containing LysR binding sequences and UP element/ LysR sequences upstream of PtRNA , respectively, were screened for high GFP activities. The GFP activities of selected clones harboring pUP-UP140, pLL-172, pLL-209 and pUL-146 were 1.56-, 2.70-, 2.37-, 3.40- and 3.15- fold, respectively, higher than that of control (pKT-GFP). DNA sequence analysis revealed that there are three copies of UP element in pUP-UP140. In plasmids pLL-172, pLL-209 and pUL-146, the transcriptiontranslation terminator upstream of the regulatory sequences was deleted. Therefore, the high GFP activities might be due to the read-through transcripts. For optimal translation initiators, Synechococcus harboring the synthetic Shine-Dalgarno (SD)/ non-SD sequence libraries containing randomized decanucleotide region upstream of the gfp gene were screened for high GFP activities. The level of gfp mRNA of the selected clones was determined using real-time PCR and the translation efficiency was analyzed. The translation efficiencies of SD-like sequences: AGGAGAAUGA, AAUGGAAAUA and AAUUGGAUUU were 2.38-, 3.96- and 4.89-fold, respectively, higher than that of control (GGUGGU), indicating that the SD-like sequences were highly efficient for translationinitiation. However, the translation efficiency of non-SD sequence, AUGUCAACUU, was not significantly different from that of control. The translation efficiencies of E. coli non- SD sequences UUCAAUAUUU, AUUUACCUCC and CCAAUCUAC were apparently lower than that of control. Therefore, the results indicated that the non-SD sequences could be translation initiator in Synechococcus, but were less efficient than SD-like sequences. The translation efficiencies of consensus-SD sequences AAGGAGGU, AGGAGGU, AAAGGAGG and AGGAGG were 12.24-, 10.52-, 6.36- and 3.77-fold, respectively, higher than that of control. Thus, the consensus-SD sequences were more efficient for translation initiation than the SD-like sequence and AAGGAGGU was the optimal translation initiator in Synechococcus. For translation enhancer, the present of BoxA of E.coli rrnB and pyrimidine-rich enhancer upstream of translation initiators did not enhance but decreased the translation efficiency. Therefore, the E. coli translation enhancer did not function in Synechococcus. The active region of rrnA regulatory sequence of Synechococcus was identified using deletion analysis. The GFP activity of active rrnA regulatory sequence upstream of the consensus-SD sequence was 23.97- fold higher than that of control. The activity of E. coli σ 70 promoter ( Psig70) upstream of the consensus-SD sequence in Synechococcus was also investigated. Results showed that the GFP activity of the Psig70 was 6.17-fold higher than that of control. In order to construct regulatory sequences which are highly active exceeding the natural cyanobacterial regulatory sequences, plasmids harboring combination of tandem enhancer/ promoter and consensus-SD sequence were constructed. Results showed that the GFP activities of Synechococcus harboring plasmids with tandem promoters PrnnA -PrnnA (pRRSC), Psig70- PrnnA (pS70-RSC) and Psig70- PrnnA- PrnnA (pS70-2RSC) were 32.33-, 36.66- and 35.88- fold, respectively, higher than that of control. When the total protein extracted from Synechococcus harboring plasmids pS70-2RSC and pS70-RSC were subjected to SDS-PAGE and stained with Comassie brilliant blue, the GFP band was visualized. To our knowledge, this is the first report that the expression of heterologous protein in Synechococcus is high enough to be detected by SDS-PAGE stained with Comassie brilliant blue. Thus, we have successfully constructed the synthetic regulatory sequences which are highly active exceeding the natural cyanobacterial regulatory sequences.