งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงโครงร่างของส่วน RTX ของ Bordetella pertussis Adenylate Cyclase Toxin เมื่อจับกับแคลเซียม โดยได้เตรียมคลังของ Naive scFv phage antibody เพื่อนำไปใช้คัดเลือกหา antibodies ที่สามารถจับกับ RTX subdomain ในอนาคตต่อไป โปรตีนขนาด 100 KDa ของ CyaA-RTX ซึ่งมีบริเวณที่จับกับแคลเซียมอยู่ได้ถูกแสดงออกใน E. coli ได้รูปแบบที่ละลายน้ำได้ และพบว่าไวต่อการถูกย่อยสลายโดยเอนไซม์โปรติเอสได้ การใช้แคลเซียมในปริมาณระดับมิลลิโมลาร์ สามารถช่วยยับยั้งการถูกทำลายได้ดีกว่าการใช้ตัวยับยั้งเอนไซม์โปรติเอส นอกจากนี้ผลของแคลเซียมยังแปรผันตามความเข้มข้น แสดงให้เห็นถึงบทบาทของแคลเซียมต่อความคงตัวของโครงสร้างของโปรตีน จากแบบแผนของแถบโปรตีนที่ถูกย่อยสลายได้ เป็นไปได้ว่าโปรตีน RTX subdomain นี้อาจมีความสามารถในการย่อยสลายตัวเอง ซึ่งยังคงต้องได้รับการศึกษาเพิ่มเติมว่าจะเป็นลักษณะของ Zn metalloprotease หรือไม่ การศึกษาต่อไปในอนาคตในด้านโครงสร้างสามามิติ หรือการใช้ฟาจ-แอนติบอดีในการศึกษาการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง น่าจะให้ข้อมูลเชิงลึกมากขึ้นเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและการทำงานของโปรตีน CyaA หรือ ACT ได้ This project aims to study the structural change of the RTX domain of the B. pertussis Adenylate Cyclase Toxin upon calcium binding. Naïve Single chain variable fragment (scFv) phage antibodies were generated. These antibodies will be a valuable tool to study the detailed calcium-dependent conformational change of the ACT. A 100-kDa RTX (Repeat-in-ToXin) fragment (CyaA-RTX) containing a number of putative calcium-binding repeats was expressed as a soluble form in a protease-deficient E. coli strain BL21(DE3)pLysS, was found to be highly sensitive to proteolytic degradation. The addition of calcium ions in a millimolar range into the CyaA-RTX preparation could significantly prevent the degradation when compared to certain protease inhibitors. Moreover, levels of proteolytic degradation were dependent on calcium concentrations, implying an important role for calcium-binding sites in the RTX subdomain for structural stability. Patterns of protease-resistant fragments of the purified RTX protein suggest the possibility that the 100-kDa RTX subdomain contains an autocleavage activity. At this stage, it remains a challenge for experimental approaches to prove whether the CyaA-RTX protein is a Zn metalloprotease. X-ray crystallography of the protein or epitope mapping by phage display technology would pave the way to an understanding of the detailed mechanisms of CyaA in terms of structure-function relationship.