โปรตีนสารพิษ Adenylate cyclase-haemolysin (CyaA) เป็นปัจจัยก่อโรคที่สำคัญอย่างหนึ่งของเชื้อ Bordetella pertussis ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคไอกรน โดยพบว่าเฉพาะส่วนของโปรตีนสารพิษที่ทำให้เกิดรูรั่วที่เยื่อหุ้มเซลล์ (poreforming domain) มีส่วนร่วมในการเกิดรูรั่วและทำให้เม็ดเลือดแดงแกะแตกได้ จากการศึกษาก่อนหน้านี้ของกลุ่ม ผู้วิจัยพบว่าโปรตีนเกลียวอัลฟาในบริเวณที่ไม่ชอบน้ำ (hydrophobic domain) ของ CyaA ซึ่งได้จากการทำนาย โครงสร้าง คือ α1500-522, α2529-550, α3571-593 and α5678-698 มีบทบาทสำคัญต่อฤทธิ์ในการทำให้เม็ดเลือดแดงแกะ แตกและได้เสนอว่าส่วนของ α3 น่าจะเป็นโครงสร้างด้านที่หันเข้าหาช่องกลวงของรูรั่วที่เกิดขึ้น ในการศึกษานี้ได้มี การสร้างแบบจำลองของบริเวณที่ไม่ชอบน้ำของ CyaA (CyaA hydrophobic region, Leu500-Ser700) ด้วยวิธี homology modelling โดยใช้โครงสร้างของ bovine rhodopsin เป็นต้นแบบ พบว่าโครงสร้างนี้ประกอบด้วย โปรตีนเกลียวอัลฟา จำนวน 5 เกลียว คือ α1501-519, α2527-556, α3566-588, α4612-640 และ α5650-685 ซึ่งผลที่ได้คล้าย กับแบบจำลองที่ทำนายในการศึกษาก่อนหน้านี้ จากแบบจำลองที่ได้และผลจากการทำ multiple sequence alignment ของโปรตีนเกลียวอัลฟา 3 ซึ่งมีการเรียงตัวของกรดอะมิโนเหมือนกับโปรตีนอื่นๆในกลุ่ม pore-forming RTX-cytotoxin ค่อนข้างมาก ผู้วิจัยจึงต้องการศึกษาผลของกรดอะมิโนซึ่งเรียงตัวเป็นโครงสร้างของด้านที่ชอบน้ำ ของโปรตีนเกลียวอัลฟา 3 ต่อฤทธิ์ในการทำให้เม็ดเลือดแดงแกะแตก โดยศึกษาความสำคัญของกรดอะมิโนที่มีขั้วและ กรดอะมิโนที่มีประจุจำนวน 5 ตัว คือ Glu570, Gln574, Glu581, Ser584 และ Ser585 นำมาทำให้เกิดการกลายพันธุ์โดย วิธี alanine scanning mutagenesis และมีการตรวจสอบความถูกต้องของพลาสมิดกลายพันธุ์ที่สร้างขึ้น (E570A, Q574A, E581A, S584A และ S585A) โดยวิธี restriction analysis และ DNA sequencing ส่วนโปรตีนสารพิษ กลายพันธุ์ขนาด 126 kDa ที่ได้จะถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยดูจากขนาด ผลการทำ Western blot analysis และการเกิด acylation ว่าเหมือนกันกับโปรตีนสารพิษต้นแบบ และเมื่อนำโปรตีนสารพิษที่ละลายน้ำในสารที่ได้จาก การทำให้เซลล์ E. coli แตกไปทดสอบฤทธิ์ในการทำให้เม็ดเลือดแดงแกะแตก พบว่ากรดอะมิโน Glu570 ซึ่งพบใน โปรตีนกลุ่ม pore-forming RTX cytotoxin ในตำแหน่งเดียวกันทุกตัว มีความสำคัญต่อการเกิดรูรั่วที่เยื่อหุ้มเซลล์ โดยอาจเป็นโครงสร้างสำคัญของด้านที่หันเข้าหาช่องกลวงของรูรั่วที่เกิดขึ้นและมีความสำคัญต่อการผ่านของไอออน Adenylate cyclase-haemolysin (CyaA) toxin from Bordetella pertussis is unique in that it contains an adenylate cyclase (AC) domain in addition to the common pore-forming (PF) domain of RTX-toxin family. The truncated pore-forming domain of CyaA (CyaA-PF) has been shown to involve in pore-formation and cause lysis of sheep erythrocytes. In our earlier work, the predicted α1500-522, α2529-550, α3571-593 and α5678-698 within the PFhydrophobic stretch were found crucial for haemolytic activity, and α3 was proposed to be a pore-lining constituent. Here, a plausible 3D-structure of the CyaA hydrophobic region (CyaA-HPR, Leu500-Ser700) was built by homology modelling based on the known bovine rhodopsin structure. The model comprised five α-helical bundles (α1501-519, α2527-556, α3566- 588, α4612-640 and α5650-685), which mostly resemble previously predicted model. Based on these models and multiple sequence alignment of the putative pore-lining amphipathic-α3 of CyaA-PF, possible involvement in haemolytic activity of the conserved hydrophilic part was investigated. Five polar or charged residues lining the hydrophilic side (Glu570, Gln574, Glu581, Ser584 and Ser585) have been selected for single-alanine substitutions mutagenesis. The mutant plasmids (E570A, Q574A, E581A, S584A and S585A) were verified by restriction mapping and DNA sequencing. All the 126-kDa mutant proteins over-expressed in Escherichia coli were confirmed by size, Western blot analysis and also acylation pattern as conformed to the wild type toxin. When hemolytic activity of E. coli lysates containing soluble mutant toxins was tested against sheep erythrocytes, the importance of Glu570, which is highly conserved among the pore-forming RTX cytotoxin family, was revealed for pore formation, possibly crucial for a general pore-lining structure involved in ion conduction.