วัณโรคเป็นสาเหตุสำคัญของการป่วยและการเสียชีวิตในหมู่ประชากรทั่วโลก มีรายงานผู้เสียชีวิตจากวัณโรคประมาณปีละ 2-3 ล้านคนและมีผู้ป่วยใหม่ประมาณ 8-10 ล้านคนในแต่ละปี การเพิ่มขึ้นของอุบัติการณ์การติดเชื้อเอชไอวีทำให้ปัญหาวัณโรคทวีความรุนแรงมากขึ้น โดยวัณโรคเป็นโรคฉวยโอกาสที่พบบ่อยเป็นอันดับหนึ่งในผู้ติดเชื้อเอชไอวีในประเทศไทย โดยในปีค.ศ.1998 พบว่าประมาณร้อยละ 20 ของผู้ป่วยเอดส์ป่วยเป็นวัณโรค นอกจากนี้การรายงานพบเชื้อวัณโรคดื้อยาหลายขนาน (multidrug resistant Mycobacterium, MDR-TB) ทำให้เกิดปัญหาในการรักษาตลอดจนการป้องกันและควบคุมวัณโรคที่เกิดจากเชื้อดื้อยานี้ ดังนั้นการศึกษาถึงกลไกการดื้อยาของเชื้อวัณโรคจะทำให้เกิดองค์ความรู้ใหม่ที่เป็นแนวทางหนึ่งในการแก้ไขปัญหาที่เกิดขึ้น การรักษาผู้ป่วยวัณโรคชนิด MDR-TB โดยทั่วไปจะใช้ยาในกลุ่ม second-line drug เช่น fluoroquinolones และ aminoglycosides เป็นต้น อย่างไรก็ตามฤทธิ์ของยาต่อเชื้อวัณโรคและผลข้างเคียงของยาเป็นข้อจำกัดในการใช้ยากลุ่มนี้ ยาในกลุ่ม macrolide เช่น clarithromycin (14-membered macrolide) ซึ่งออกฤทธิ์ได้ดีกับเชื้อมัยโคแบคทีเรียอื่นๆ ยกเว้นเชื้อวัณโรคซึ่งโดยธรรมชาติจะดื้อต่อยานี้โดยกลไกที่ยังไม่ทราบ ค่า minimal inhibitory concentration (MIC) ของเชื้อวัณโรคต่อ clarithromycin (MIC=8-20ug/ml) จะสูงค่ากว่า MIC ของเชื้อมัยโคแบคทีเรียอื่นๆต่อยานี้ เช่น Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC) Mycobacterium bovis BCG และ Mycobacterium smegmatis จะไวต่อยานี้ (MIC=1-8 ug/ml) การศึกษาในแบคทีเรียกรัมบวกพบว่าการที่เชื้อมีกลไกที่สามารถขับยาออกนอกเซลล์โดยอาศัยโปรตีนที่ทำหน้าที่เป็น macrolide efflux pump ทำให้เชื้อดื้อต่อยาทำให้สันนิษฐานว่ากลไกเช่นนี้น่าจะพบในเชื้อวัณโรคและเป็นสาเหตุทำให้เชื้อดื้อต่อยากลุ่มนี้โดยธรรมชาติ ซึ่งยังไม่มีผู้ใดได้ศึกษาและรายงานมาก่อน การศึกษานี้มุ่งที่จะทำการแยกและศึกษาคุณสมบัติของยีนที่สร้างโปรตีนที่มีคุณสมบัติเป็น macrolide efflux pump ในเชื้อวัณโรค โดยการศึกษานี้ใช้ clarithromycin เป็นตัวแทนของยากลุ่ม macrolide การศึกษาหายีนนี้ทำได้โดย (1) การโคลน genomic DNA ของเชื้อวัณโรคสายพันธุ์มาตรฐาน (M. tuberculosis H37Rv) และให้แสดงออก (expression) ใน M. smegmatis โดยการคัดเลือกหาโคลนที่ดื้อต่อ clarithromycin แยกยีนที่ทำให้ M. smegmatis ดื้อต่อยานี้และทำการศึกษาหาคุณสมบัติของยีนที่แยกได้ โดยการหาลำดับนิวคลิโอไทด์เปรียบเทียบกับข้อมูลในฐานข้อมูล GenBank เพื่อยืนยันว่ายีนที่แยกได้นั้นมีผลต่อการดื้อยา clarithromycin จริง จึงทำการถ่ายทอดยีนเข้าสู่เซลล์ของ M. smegmatis และ M.bovis BCG โดยวิธี electroporation แล้วศึกษา transformants ที่ได้โดยหาค่า MIC ของเชื้อต่อ clarithromycin (2) ทำการโคลนยีนที่มีลักษณะและคุณสมบัติคล้ายกับ macrolide efflux pump จากการทำ homology search ได้แก่ Rv1473, Rv1667c, Rv1668C และ Rv2477c แล้วศึกษาผลของยีนเหล่านี้ต่อการดื้อยา clarithromycin ในเชื้อ M. smegmatis และM.bovis BCG ผลการทดลองพบว่า (1) ไม่สามารถแยกยีนที่ทำให้เชื้อ M. smegmatis ดื้อต่อ clarithromycin ได้จากการทำ genomic library (2) ยีนRv1473, Rv1667c, Rv1668C และ Rv2477c ไม่มีผลทำให้เชื้อดื้อต่อ clarithromycin ดังนั้นจากผลการทดลองยังไม่สามารถสรุปได้ว่าเชื้อวัณโรคดื้อต่อยากลุ่ม macrolide โดยธรรมชาติได้ด้วยกลไกใด แต่สามารถสรุปได้ว่ายีน Rv1473, Rv1667c, Rv1668C และ Rv2477c ไม่มีความเกี่ยวข้องกับการดื้อยากลุ่ม macrolide อย่างไรก็ตามจากรายงานที่ตีพิมพ์เมื่อเร็วๆนี้ และจากการศึกษา genetic difference ระหว่างเชื้อวัณโรคกับเชื้อ M.bovis BCG พบยีนที่อาจมีความเกี่ยวข้องกับการดื้อยากลุ่ม macrolide ได้แก่ยีน Rv1988 ซึ่งมีความจำเป็นที่ต้องทำการศึกษาต่อไป เพื่อให้รู้ถึงกลไกที่ทำให้เชื้อวัณโรคดื้อยากลุ่มนี้ และเพื่อที่จะใช้เป็นแนวทางในการพัฒนายาต้านวัณโรคชนิดใหม่ๆ และเป็นประโยชน์ในการปรับปรุงสูตรยาสำหรับรักษาวัณโรคโดยเฉพาะเชื้อวัณโรคชนิด MDR-TB

Tuberculosis (TB) causes significant morbidity and mortality throughout the world, with 2-3 million deaths annually and 8-10 million new cases. The increasing incidence of AIDS patients makes the TB problems more seriously. Tuberculosis is the leading opportunistic infection found in AIDS patients in Thailand, as reported in 1998 approximately 20% od AIDS patients suffered from TB. The emergence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) significantly increases the problems of treatment, prevention and control of the disease. The studies of resistant mechanisms, therefore, provide a new insight which would be one of the strategies to solve these problems. Generally, the second-line drugs such as fluoroquinolones and aminoglycosides are used for treatment of MDR-TB. However, their activity against MTB are less efficient and their side effects limit the usefulness of these drugs. Macrolides such as clarithromycin (14-membered macrolide) are active against other mycobacteria except MTB that is naturally resistant to these drugs by unknown mechanism. M. tuberculosis shows higher minimal inhibitory concentration (MIC=8-20ug/ml) than other susceptible mycobacteria, i.e., Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC), Mycobacterium bovis BCG, and mycobacterium smegmatis (MIC=1-8ug/ml). The presence of macrolide efflux pumps has been reported in Gram positive cocci as the mechanism of macrolide resistance. We hypothesize that the macrolide efflux pump, which has never been investigated in mycobacteria, may be found in MTB and is responsible for intrinsic macrolide resistance. Clarithromycin was used in this study as representative of macrolides. This study aims to isolate and characterize the gene or genes encoding the macrolide efflux pump in MTB. The gene encoding the efflux pump is isolated by (1) construction of genomic library of M. tuberculosis H37Rv and expressing the genomic DNA in M. smegmatis and selection for clarithromycin resistant mutants. The gene conferring clarithromycin resistance is characterized by DNA sequencing and comparing the nucleotide sequence with those from GenBank database. To confirm the results obtained, the gene conferring clarithromycin resistance is transformed into M. smegmatis and M. bovis BCG. The phenotype of the obtained transformants is investigated by determining the MIC to clarithromycin. (2) cloning the putative macrolide efflux protein encoding genes from homology search such as Rv1473, Rv1667c, Rv1668C and Rv2477c. These genes were transformed into M. smegmatis and M. bovis BCG and the obtained transformants were investigated for clarithromycin resistant phenotype. The results demonstrated that (1) the gene responsible for intrinsic macrolide resistance was not isolated from screening of genomic library (2) the cloned genes Rv1473, Rv1667c, Rv1668C and Rv2477c did not conferred macrolide resistance when they were transformed into both M. smegmatis and M. bovis BCG. From these results, the mechanism of macrolide resistance in MTB was not elucidated in this study but it was concluded that Rv1473, Rv1667c, Rv1668C and Rv2477c were not responsible for macrolide resistance. However, the recent study and the study of genetic difference between MTB and M. bovis BCG indicated Rv1988 may be responsible for macrolide resistance in MTB. The further study of this gene should be concentrated in order to explain why macrolides are inactive against MTB and this mechanism may occur as intrinsic resistant mechanism of MTB against other antimicrobial agents. Furthermore, these results may suggest how to develop new antituberculous drugs or to improve therapeutic regimens for treatment of MDR-TB.