งานวิจัยในตอนที่ 1 สามารถคัดแยกแบคทีเรียสร้างเอนไซม์ไลเปสจำนวน 12 สายพันธุ์ จากตัวอย่างของเสียที่มีการปนเปื้อนน้ำมันปาล์ม โดยอาศัยคุณสมบัติที่แบคทีเรียดังกล่าวมีการเรืองแสงสีส้มบนอาหารแข็งที่มีองค์ประกอบของ Rhodamine B ภายใต้แสงยูวี จากการตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสที่ถูกขับออกนอกเซลล์ พบว่าสามารถคัดเลือกแบคทีเรียได้เพียง 1 สายพันธุ์ คือ AU2 โดยตรวจพบกิจกรรมของเอนไซม์สูงสุดเมื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ที่อุณหภูมิ 45 °C จากการจัดจำแนกสายพันธุ์ด้วยวิธีการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 16S rRNA พบว่าสายพันธุ์ดังกล่าวคือ Burkholderia multivorans AU2 แบคทีเรียสายพันธุ์นี้มีกิจกรรมของเอนไซม์และความเข้มข้นของโปรตีนเซลล์ทั้งหมดสูงสุด (6.18 U/ml, 2.42 mg/ml) ภายหลังการเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในอาหาร growth medium (pH 7.0) ที่มีองค์ประกอบของน้ำมันปาล์ม 1% (v/v) และ yeast extract 0.4% (w/v) ที่อุณหภูมิ 37 °C ภายใต้สภาวะการเขย่าที่ความเร็ว 150 รอบต่อนาที ค่าพีเอชที่เหมาะสมต่อกิจกรรมของเอนไซม์คือพีเอช 8.0 และเอนไซม์มีกิจกรรมสูงสุดเมื่อทำการวิเคราะห์ที่อุณหภูมิ 60 °C เอนไซม์มีความเสถียรในช่วงค่าพีเอชที่ค่อนข้างกว้าง โดยตรวจพบกิจกรรมของเอนไซม์ที่เหลืออยู่มากกว่า 50 เปอร์เซ็นต์ ภายหลังการบ่มเอนไซม์ไว้ที่ช่วงค่าพีเอช 3.0-11.0 เอนไซม์แสดงคุณสมบัติของการเป็นเอนไซม์ทนอุณหภูมิสูงเนื่องจากยังคงมีกิจกรรมเหลืออยู่กว่า 35% ภายหลังการบ่มที่อุณหภูมิ 60 °C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง เอนไซม์มีประสิทธิภาพในการไฮโดรไลซีส (hydrolysis) น้ำมันปาล์ม โดยเมื่อปล่อยให้เกิดปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้อง (30 + 1 °C) เป็นเวลา 72 ชั่วโมง พบว่า 67% ของ triacylglyceroal (TAG) ถูกเปลี่ยนไปเป็นกรดไขมันอิสระ (FFA) (38%), diacylglycerol (DAG) (27.7%) และ monoacylglycerol (MAG) (6.8%) อย่างไรก็ตามเอนไซม์มีกิจกรรมการกระตุ้นปฏิกิริยาทรานเอสเทอริฟิเคชั่น (transesterification) ที่ต่ำ โดยตรวจพบผลิตผลหรือ fatty acid methyl ester (FAME) เพียง 14.98% จากปฏิกิริยาที่ใช้อัตราส่วนโมลของน้ำมันปาล์มต่อโมลของเมทานอลเท่ากับ 1:1 และเมื่อเพิ่มอัตราส่วนดังกล่าวเป็น 1:3 จะตรวจไม่พบกิจกรรมของเอนไซม์ในการกระตุ้นปฏิกิริยาการเปลี่ยน TAG ไปเป็น FAME เมื่อทำการศึกษาต่อโดยเปลี่ยนมาใช้เซลล์ของ Burkholderia multivorans AU2 (1x1010 CFU) ที่อัตราส่วนโมลของน้ำมันปาล์มต่อโมลของเมทานอลเท่ากับ 1:3 พบว่าเอนไซม์สามารถกระตุ้นกิจกรรมการเปลี่ยน TAG ไปเป็น FAME ได้ 48.3% งานวิจัยในตอนที่ 2 ได้นำแบคทีเรียทนอุณหภูมิสูงที่คัดแยกจากกองปุ๋ยหมักมาใช้เป็นแหล่งของแบคทีเรียผลิตเอนไซม์ไลเปส โดยคัดเลือกจากการเจริญบนอาหารสังเคราะห์ที่มีองค์ประกอบของน้ำมันปาล์มและ Rhodamine B ที่อุณหภูมิ 50 °C แบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์ ไลเปสจะเรืองแสงสีส้มภายใต้แสงยูวี สามารถคัดเลือกแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์ไลเปสในระดับสูงได้ทั้งหมด 10 สายพันธุ์ เมื่อจัดจำแนกโดยวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 16S rRNA พบว่าเป็น Aneurinibacillus thermoaerophilus 1 สายพันธุ์, Bacillus pumilus 1 สายพันธุ์ และ Bacillus thermoamylovorans 8 สายพันธุ์ ในการศึกษาครั้งนี้ได้เลือก Bacillus thermoamylovorans BHK52 ซึ่งผลิตเอนไซม์ไลเปสได้สูงและยังไม่พบข้อมูลของเอนไซม์ไลเปสบนฐานข้อมูล มาใช้สำหรับการโคลนยีน การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ การศึกษาการแสดงออกของยีน และการศึกษาคุณสมบัติบางประการของเอนไซม์ดังกล่าว โดยทำการออกแบบ degenerate primers จากลำดับนิวคลีโอไทด์ตรงบริเวณอนุรักษ์ของยีนไลเปสในกลุ่ม Bacillus spp. เพื่อใช้ในการเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนของยีนไลเปสด้วยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) หลังจากนั้นทำ อินเวอร์สพีซีอาร์ (Inverse PCR) เพื่อหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนไลเปสทั้งหมด จากการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนไลเปสที่ได้ (lip52) พบว่ามีขนาด open reading frame (ORF) ขนาด 1,221 คู่เบส สามารถแปลรหัสเป็นกรดอะมิโน 407 หน่วย เมื่อวิเคราะห์ลำดับของกรดอะมิโนกับโปรตีนในฐานข้อมูลพบว่าเอนไซม์ไลเปส (Lip52) ไม่มีความเหมือนอย่างสมบูรณ์กับโปรตีนที่ปรากฏอยู่บนฐานข้อมูล อย่างไรก็ตามเอนไซม์ไลเปสดังกล่าวมีความเหมือนในระดับปานกลาง (24–51%) เมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์ไลเปสที่มีการศึกษามาแล้ว แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ไลเปสที่ได้นี้เป็นเอนไซม์ไลเปสชนิดใหม่ จากการวิเคราะห์ยังพบบริเวณที่มีการเรียงลำดับของกรดอะมิโน (motif) แบบอนุรักษ์ซึ่งพบในกลุ่มของเอนไซม์ไลเปสและเอสเทอเรสคือ GXSXG เมื่อนำยีน lip52 ไปแสดงออกใน Escherichia coli JM109 จากนั้นนำเอนไซม์ที่ได้ไปผ่านขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์แล้วนำไปศึกษาถึงคุณสมบัติบางประการของเอนไซม์ พบว่าเมื่อวิเคราะห์ด้วยวิธี SDS-PAGE เอนไซม์ไลเปสมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 45 กิโลดาลตัน เอนไซม์มีค่าพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมกับการทำงานคือ 8.0 และ 90 °C ตามลำดับ เอนไซม์มีความเสถียรสูงในช่วงค่าพีเอช 5.0-10.0 และในช่วงอุณหภูมิ 30–100 °C สับสเตรทที่เหมาะสมสำหรับการเกิดกิจกรรมของเอนไซม์ในระดับสูงสุดคือ p-nitrophenyl caprylate (C8) จึงพอที่จะสรุปได้ว่าโปรตีน Lip52 คือ เอนไซม์ไลเปสไม่ใช่เอนไซม์เอสเทอเรส From the first part of this project, a total of 12 lipase-producing bacterial strains showed orange fluorescent colonies on Rhodamine B agar medium under UV light were isolated from palm oil contaminated wastes. Their extracellular lipase activities were also investigated. One bacterial strain named AU2 was selected since it showed the highest level of lipase activity after growing at 45 °C. It was identified as Burkholderia multivorans AU2 by using nucleotide sequence analysis of 16S rRNA gene. The maximum lipolytic activity (6.18 U/ml) and total cell protein concentration (2.42 mg/ml) were achieved after 24 h of cell cultivation in growth medium (pH 7.0) containing 1% (v/v) of palm oil and 0.4% (w/v) of yeast extract under shaking condition (150 rpm) at 37 °C. The enzyme had an optimum pH of 8.0 and showed maximal activity at 60 °C. This lipase exhibited the stability in a wide pH range since it retained more than 50% of residual activity after 3 h of preincubation within a pH range of 3.0-11.0. The enzyme was comparatively thermostable since it retained approximately 35% of lipolytic activity after 3 h of preincubation at 60 °C. The enzyme exhibited the effectiveness of palm oil hydrolysis where 67% of triacylglycerol (TAG) was converted to free fatty acid (FFA) (38%), diacylglycerol (DAG) (27.7%) and monoacylglycerol (MAG) (6.8%) after 72 h at room temperature (30 + 1 °C). However, it showed low catalytic activity in transesterification reaction since only 14.98% of fatty acid methyl ester (FAME) was observed when 1:1 molar ratio of oil to methanol was applied. No conversion of TAG to FAME was detected in transesterification reaction when 1:3 molar ratio of oil to methanol was applied. Further investigation by using whole cell of Burkholderia multivorans AU2 (1x1010 CFU) together with 1:3 molar ratio of oil to methanol has successfully increased the FAME synthesis to approximately 48.3%. From the second part of this project, the thermotolerant bacteria isolated from composts were used as sources of lipase-producing bacteria. The bacterial strains were screened and scored positive as they showed orange fluorescent colonies under UV light after cultivation on lipase assay medium containing palm oil and Rhodamine B at 50 ˚C. A total of 10 bacterial strains exhibiting high levels of lipase activity were selected. Those strains were identified as 1 isolate of Aneurinibacillus thermoaerophilus, 1 isolate of Bacillus pumilus, and 8 isolates of Bacillus thermoamylovorans by 16S rRNA gene sequence analysis. As no report was found on a lipase from Bacillus thermoamylovorans so far its target lipase was supposed to be a novel one, Bacillus thermoamylovorans BHK52 was selected for further gene cloning, nucleotide sequencing, expression and partial characterization. Degenerate primers were designed according to the sequences of two highly conserved regions of lipases among Bacillus spp. and used to amplify a part of lipase gene by PCR. After that, inverse PCR was performed to amplify the whole nucleotide sequence of lipase gene. Sequence analysis of the lipase gene (lip52) showed an open reading frame (ORF) of 1,221 bp encoding for a mature lipase of 407 amino acids. Amino acid sequence analysis revealed that the lipase Lip52 did not match perfectly with any known proteins in the databases. However, it showed only moderate sequence identity (24 – 51%) with the known lipases. This indicates that the lipase Lip52 is a novel enzyme. It contains a typical GXSXG motif found in most esterases and lipases. The lip52 gene was expressed in Escherichia coli JM109, purified and partially characterized. The molecular mass of the lipase Lip52 was determined to be approximately 45 kDa by SDS–PAGE. The enzyme had an optimum pH of 8.0 and showed maximal activity at 90 ˚C. It was highly stable within a pH range of 5.0–10.0 and a temperature range of 30 –100 ˚C. The highest activity was observed when p-nitrophenyl caprylate (C8) was used as a synthetic substrate, which can be concluded that the lipase Lip52 is a true lipase but not esterase.