การติดเชื้อ monodon baculovirus (MBV) ในกุ้งกุลาดำมีผลทำให้กุ้งที่ติดเชื้อเจริญเติบโตช้าและมีขนาดเล็กลงอย่างเห็นได้ชัด ส่วนในกรณีของการติดเชื้อแบคทีเรีย Vibrio parahaemolyticus จัดเป็นจุลชีพฉวยโอกาสที่ก่อให้เกิดโรคเมื่อกุ้งหรือสัตว์น้ำอยู่ในสภาวะเครียด นอกจากนี้ V. cholerae และ V. parahaemolyticus ยังเป็นสาเหตุสำคัญของการเกิดโรคอาหารเป็นพิษในมนุษย์ หากรับประทานอาหารทะเลที่ปนเปื้อนเชื้อดังกล่าว ดังนั้นการตรวจวินิจฉัยที่รวดเร็ว ถูกต้องและแม่นยำจึงเป็นสิ่งสำคัญ วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เป็นการพัฒนาวิธี loop-mediated isothermal amplification (LAMP) เพื่อใช้ในการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ MBV เชื้อ V. cholerae และ V. parahaemolyticus สามารถพัฒนาวิธี LAMP สำหรับตรวจการติดเชื้อ monodon baculovirus (MBV) หรือ Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus (PemoNPV) ในกุ้งกุลาดำได้สำเร็จ โดยมียีนเป้าหมายคือ polyhedrin gene พบว่าสภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยาคือการใช้ อุณหภูมิที่ 63°C เป็นเวลา 60 นาที มีความไวในการตรวจ PemoNPV ประมาณ 50 อนุภาคต่อ 1 นาโนกรัมของ genomic DNA หรือ 150 อนุภาคต่อปฏิกิริยา จากการใช้ DNA ต้นแบบที่สกัดจากกุ้งที่ติดเชื้อ PemoNPV (โดยใช้ชุดสกัดกรดนิวคลีอิกของไวรัสที่มีขายเชิงพาณิชย์) พบว่าเทคนิค LAMP มีความไวประมาณ 0.7 เฟมโตกรัม ในขณะที่วิธี nested PCR มีความไวประมาณ 70 เฟมโตกรัม แสดงให้เห็นว่าเทคนิค LAMP มีความไวมากกว่า nested PCR 100 เท่า นอกจากนี้เทคนิค LAMP ที่พัฒนาขึ้นมีความจำเพาะต่อ PemoNPV โดยไม่ทำปฏิกิริยาข้ามกับไวรัสชนิดอื่นๆ ของกุ้งได้แก่ ไวรัสหัวเหลือง (YHV) ไวรัสโรคทอร่า (TSV) ไวรัสจุดขาว (WSSV) และไวรัสที่ทำให้เกิดโรคแคระแกร็น 2 ชนิดได้แก่ PstDNA หรือชื่อเดิมว่า IHHNV และ PmDNV หรือชื่อเดิมว่า HPV สามารถพัฒนาวิธี LAMP สำหรับตรวจการติดเชื้อ V. cholerae ทุกสายพันธุ์ได้สำเร็จ โดยมียีนเป้าหมายคือ ompW โดยพบว่าสภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยาคือการใช้ อณหภูมิที่ 65°C เป็นเวลา 75 นาที มีความไวในการตรวจ V. cholerae ใน culture ได้ 2.2 x 103 CFU/ml หรือ 8 CFU ต่อปฏิกิริยา มีและมีความไวในการตรวจ V. cholerae ที่ทำให้ปนเปื้อนในตัวอย่างกุ้ง (spiked samples) ได้ 2.2 x 104 CFU/g หรือ 20 CFU ต่อปฏิกิริยา ในขณะที่วิธี PCR มีความไวประมาณ 100 CFU ต่อปฏิกิริยา ดังนั้นวิธี LAMP จึงมีความไวสูงกว่า 5 เท่า นอกจากนี้เทคนิค LAMP ที่พัฒนาขึ้นมีความจำเพาะต่อ V. cholerae ทั้ง 16 isolates ที่ใช้ทดสอบ โดยไม่ทำปฏิกิริยาข้ามกับ non-cholerae Vibrio 28 isolates และ non- Vibrio 37 isolates สามารถพัฒนาวิธี LAMP ควบคู่กับการตรวจ LAMP amplicons โดยการใช้ lateral flow dipstick (LAMP-LFD) สำหรับตรวจการติดเชื้อ V. parahaemolyticus ทุกสายพันธุ์ได้สำเร็จ โดยมียีนเป้าหมายคือ tlh โดยพบว่าสภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยาคือการใช้ อุณหภูมิที่ 65°C เป็นเวลา 90 นาที มีความไวในการตรวจ V. parahaemolyticus ใน culture ได้ 120 CFU/ml และมีความไวในการตรวจ V. parahaemolyticus ที่ทำให้ปนเปื้อนในตัวอย่างกุ้ง (spiked samples) ได้ 1.8 x 103 CFU/g หรือ 3 CFU ต่อปฏิกิริยา ในขณะที่วิธี PCR มีความไวประมาณ 30 CFU ต่อปฏิกิริยา ดังนั้นวิธี LAMP-LFD จึงมีความไวสูงกว่า 10 เท่า นอกจากนี้เทคนิค LAMP ที่พัฒนาขึ้นมีความจำเพาะต่อ V. parahaemolyticus ทั้ง 28 isolates ที่ใช้ทดสอบ โดยไม่ทำปฏิกิริยาข้ามกับ non- parahaemolyticus Vibrio 24 isolates และ non- Vibrio 35 isolates Monodon baculovirus (MBV) is a viral pathogen causing stunt growth in black tiger shrimp Penaeus monodon. In the case of bacterial infection, Vibrio parahaemolyticus is an opportunistic pathogen causing vibriosis in shrimp or marine animals under stress condition. In addition, V. cholerae and V. parahaemolyticus can cause seafood-related illnesses in human after the consumption of Vibrio-contaminated food. Therefore, the rapid and accurate diagnosis of these pathogens is imperative. This research project aims to develop loop-mediated isothermal amplification (LAMP) detection methods for MBV, V. cholerae and V. parahaemolyticus. In this report, a LAMP method was developed for detection of Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus (PemoNPV), known previously as monodon baculovirus (MBV), using a set of six primers designed to specifically recognize the PemoNPV polyhedrin gene. The optimized time and temperature conditions for the LAMP assay were 60 min at 63 °C. The sensitivity of LAMP for PemoNPV detection was approximately 50 viral copies ng-1 genomic DNA (equivalent to 150 viral copies per reaction). Using a DNA template extracted from PemoNPV-infected shrimp by a viral nucleic acid kit, the detection limit of LAMP was 0.7 fg while that of nested PCR was 70 fg; therefore, the LAMP assay was 100 times more sensitive than nested PCR. The LAMP method did not amplify a product using nucleic acid extracted from shrimp infected with other viruses including yellow head virus (YHV), Taura syndrome virus (TSV), white spot syndrome virus (WSSV), Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) known previously as infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and Penaeus monodon densovirus (PmDNV) known previously as hepatopancreatic parvovirus (HPV). A LAMP method for detection of V. cholerae was successfully developed. A set of five designed primers that recognized specifically the V. cholerae ompW gene was used. The optimized time and temperature conditions for the LAMP assay were 75 min at 65°C. The LAMP method accurately identified 16 isolates of V. cholerae but did not detect 28 non-cholerae Vibrio isolates, and 37 non-Vibrio bacterial isolates. The sensitivity of LAMP for V. cholerae detection in pure cultures was 2.2 x 103 CFU ml-1 or equivalent to 8 CFU per reaction. In the case of spiked shrimp samples without enrichment, the detection limit for V. cholerae was 2.2 x 104 CFU g-1 or equivalent to 20 CFU per reaction while that of PCR was 100 CFU per reaction. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with amplicon detection by chromatographic lateral flow dipstick (LFD) assay for rapid and specific detection of Vibrio parahaemolyticus was successfully developed. Biotinylated LAMP amplicons were produced by a set of four designed primers that recognized specifically the V. parahaemolyticus thermolabile hemolysin (tlh) gene followed by hybridization with an FITC-labeled probe and LFD detection. The optimized time and temperature conditions for the LAMP assay were 90 min at 65°C. The LAMP-LFD method accurately identified 28 isolates of V. parahaemolyticus but did not detect 24 non-parahaemolyticus Vibrio isolates, and 35 non-Vibrio bacterial isolates. The sensitivity of LAMP-LFD for V. parahaemolyticus detection in pure cultures was 120 CFU ml-1. In the case of spiked shrimp samples without enrichment, the detection limit for V. parahaemolyticus was 1.8 x 103 CFU g-1 or equivalent to 3 CFU per reaction while that of conventional PCR was 30 CFU per reaction.