ศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของหอยเป๋าฮื้อ H. asinina, H. ovina และ H. varia ด้วย วิธี PCR-RFLP ของยีน18S rDNA และ16S rDNA ซึ่งจากการตัด18S rDNA ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ Alu I, Taq I และ Hae III และ16S rDNA ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ Bam HI, Eco RI, Hae III และ Alu I พบ รูปแบบการตัด 12 และ 13 แบบตามลำดับ โดยพบ composite haplotypesทั้งหมด 49 รูปแบบ และพบว่า composite haplotypes ของ16S rDNA สามารถตรวจสอบชนิดของหอยเป๋าฮื้อ H. asinina, H. ovina และ H. varia ได้อย่างถูกต้อง นอกจากนี้ยังสามารถใช้ composite haplotypes ของ16S rDNAจำแนกหอย เป๋าฮื้อ H. ovina ที่มาจากทะเลอันดามัน (ABBB) และอ่าวไทย (AAAB และ AABB) ได้อีกด้วย แผนภูมิ UPGMA ที่สร้างระหว่างระยะห่างทางพันธุกรรมของ composite haplotypes แสดง ให้เห็นการแบ่งแยกของ gene pool หอยเป๋าฮื้อชนิดต่างๆ โดยH. asininaมีความใกล้ชิดทางพันธุกรรม กับ H. ovina มากกว่า H. varia จากการวิเคราะห์ geographic heterogeneity และ FST พบโครงสร้าง ประชากรของหอยเป๋าฮื้อ H. ovina ที่มาจากทะเลอันดามันและอ่าวไทย (P < 0.0001) และพบความแตก ต่างทางพันธุกรรมของ H. asinina ที่มาจากฟิลิปปินส์และกลุ่มตัวอย่างอื่นๆที่ทำการศึกษา นอกจากนี้ยังทำการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมและความแตกต่างของประชากรของ H. asinina, H. ovina และ H. varia ด้วยวิธี RAPD-PCR ซึ่งพบว่าหอยเป๋าฮื้อดังกล่าวมีความหลากหลาย ทางพันธุกรรมที่สูงในทั้ง 3 ชนิด โดยความหลากหลายทางพันธุกรรมภายใน H. varia มีค่าสูงกว่า H. ovina และ H. asinina ตามลำดับ และไพรเมอร์ OPB01, UBC101, UBC195, UBC197 และ UBC271 แสดงความแตกต่างทางพันธุกรรมของ H. asinina ธรรมชาติที่มาจากทะแลอันดามัน (HATRAW) และ ฝั่งอ่าวไทย (HACAME และ HASAME) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.0001) สำหรับการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของหอยเป๋าฮื้อ H. asinina ด้วยไมโครแซท เทลไลต์นั้น ได้ทำการสร้างห้องสมุดยีน 3 แบบ ห้องสมุดแรกได้จากการตัดดีเอ็นเอของหอยเป๋าฮื้อด้วย เอนไซม์ตัดจำเพาะ Alu I ห้องสมุดยีนแบบที่สองได้จากการทำดีเอ็นเอของหอยให้ขาดด้วยการ vortex และ sonication ห้องสมุดยีนแบบที่สามได้จากการตัดดีเอ็นเอของหอยโดยใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะรวมกัน สามชนิดคือ Alu I, Rsa I และ Hinc II เมื่อตรวจหาไมโครแซเทลไลต์ด้วยตัวตรวจสอบ (GT)15 พบโคลน ที่ให้ผลบวกเท่ากับ 0.2% 0.43% และ 1.46% ตามลำดับ โดยมีไมโครแซเทลไลต์ชนิด perfect, imperfect และ compound ในอัตราส่วนที่เท่ากัน จากลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณไมโครแซเทลไลต์ที่ค้นพบจำนวน 33 ตำแหน่ง สามารถนำมาออกแบบไพร์เมอร์ได้ 10 คู่ เมื่อทดสอบความหลากหลายของไมโครแซเทล ไลต์ทั้ง 10 ตำแหน่ง (Has1 - 10) จำนวนอัลลีลที่พบอยู่ในช่วง 3 - 26 อัลลีล ค่าเฮทเทอโรไซโกซิตี้ที่พบ (observed heterozygosity, HO) และค่าเฮทเทอโรไซโกซิตี้ที่คาดคะเน (expected heterozygosity, HE) มี ค่าอยู่ในช่วง 0.24 - 0.93 v ในการศึกษาความแปรผันทางพันธุกรรมของประชากรหอยเป๋าฮื้อ H. asinina จำนวน 6 แหล่ง ซึ่งแบ่งเป็นจากธรรมชาติ 3 แหล่ง คือ หอยเป๋าฮื้อจากทะเลอันดามันซึ่งเก็บตัวอย่างจากบริเวณเกาะ ตะลิบง จังหวัดตรัง (HATRAW) หอยเป๋าฮื้อจากอ่าวไทยซึ่งเก็บตัวอย่างจากบริเวณเกาะเสม็ด จังหวัด ระยอง (HASAME) และจากประเทศกัมพูชา (HACAME) และตัวอย่างหอยเป๋าฮื้อจากโรงเพาะเลี้ยง 3 แห่ง ซึ่งมีพ่อแม่พันธุ์มาจากบริเวณเกาะเสม็ดจังหวัดระยอง (HASAMHE) จากประเทศกัมพูชา (HACAMHE) และจากประเทศฟิลิปปินส์ (HAPHIE) โดยใช้ไมโครแซเทลไลต์ที่พัฒนาได้ 3 ตำแหน่ง คือ Has2, Has3 และ Has8 พบว่าค่าเฉลี่ยของ effective number of alleles (ne) และเฮทเทอโรไซโกซิติ้ (HO) ของตัวอย่างหอยเป๋าฮื้อธรรมชาติจากอ่าวไทย (HASAME = 7.66, 0.78 และ 0.86 และ HACAME = 9.37, 0.62 และ 0.88) มีความหลากหลายทางพันธุกรรมที่สูงกว่าหอยเป๋าฮื้อธรรมชาติจากทะเลอันดา มัน (HATRAW = 6.04, 0.58 และ 0.62) เมื่อทำการวิเคราะห์ค่าทางสถิติเพื่อตรวจสอบโครงสร้างประชากรของ H. asinina ไม่พบความ แตกต่างกันทางพันธุกรรมอย่างมีนัยสำคัญของกลุ่มตัวอย่างหอยเป๋าฮื้อภายในอ่าวไทย (P > 0.0027) แต่ พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มตัวอย่างหอยเป๋าฮื้อธรรมชาติจากอ่าวไทย (HASAME และ HACAME) และทะเลอันดามัน (HATRAW) ทำการพัฒนาเครื่องหมายที่จำเพาะต่อชนิดของหอยเป๋าฮื้อ โดยนำเอาผลิตภัณฑ์ที่ได้จาก ปฏิกิริยา PCR ที่ใช้ดีเอ็นเอของตัวแทนหอยเป๋าฮื้อที่มี composite haplotype AAAA และ AAAE ซึ่งพบ ใน H. asinina AAAB, AABB และ ABBB ซึ่งพบใน H. ovina และ AABC, BABC, BABD, BABF และ BABG ซึ่งพบใน H. varia มาโคลน หาลำดับนิวคลีโอไทด์ และออกแบบไพรเมอร์ที่จำเพาะ ซึ่ง สามารถพัฒนา species-specific PCR ใน H. asinina และ H. varia โดยมีความว่องไวของการตรวจสอบ ประมาณ 25 pg และ 50 pg ของดีเอ็นเอต้นแบบจาก H. asinina และ H. varia ตามลำดับ จากการวิเคราะห์พันธุศาสตร์ประชากรของหอยเป๋าฮื้อด้วยวิธี RAPD-PCR พบเครื่องหมาย RAPDที่จำเพาะต่อชนิดจำนวน 15 เครื่องหมาย เครื่องหมายRAPDที่จำเพาะต่อกลุ่มตัวอย่างจำนวน 6 เครื่องหมาย และเครื่องหมายRAPD ขนาด 1650 bp ที่จำเพาะต่อ H. ovina ที่มาจากอ่าวไทย จึงทำการ พัฒนาเครื่องหมาย SCARs โดยการโคลนและหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของเครื่องหมายRAPD ดังกล่าว ออกแบบไพรเมอร์จำนวน 20 คู่และทำการตรวจสอบความจำเพาะเบื้องต้น (N = 12 และ 4 สำหรับตรวจ สอบ target species และ non-target species ตามลำดับ) ซึ่งพบว่าไพรเมอร์จำนวน 7 คู่ (CUHA1, CUHA2, CUHA4, CUHA11, CUHA12, CUHA13 และ CUHA14) แสดงความจำเพาะต่อ H. asinina ในขณะที่ CUHO3 และ CUHV1แสดงความจำเพาะ ต่อ H. ovina และ H. varia ตามลำดับ จึงตรวจสอบความจำเพาะของ CUHA2, CUHA12, CUHA13, CUHO3 และ CUHV1 กับตัวอย่างจำนวนมาก (N = 111, 73 และ 32 สำหรับ H. asinina, H. ovina และ H. varia ตามลำดับ) ซึ่งผลการศึกษาพบความจำเพาะของเครื่องหมายSCARs ที่พัฒนาขึ้นใน H. asinina vi (CUHA2, CUHA12 และ CUHA13) และ H. varia (CUHV1) ซึ่งมีความว่องไวของการตรวจสอบที่ดี (20 pg ของดีเอ็นเอต้นแบบจาก H. asinina และ H. varia สำหรับ CUHA12 และ CUHV1 และ 100 pg สำหรับCUHA2) เครื่องหมายSCARs ที่พัฒนาขึ้นสามารถนำไปตรวจสอบผลิตภัณฑ์แบบต่างๆของ H. asinina ได้อย่างถูกต้อง Genetic diversity of abalone in Thailand; Haliotis asinina, H. ovina, and H. varia were analysed by PCR-RFLP of 18S and 16S rDNAs. Restriction analysis of 18S (nuclear) rDNA with Alu I, Taq I and Hae III and 16S (mitochondrial) rDNA with Bam HI, Eco RI, Hae III and Alu I gave 12 and 13 digestion patterns, respectively. A total of 49 composite haplotype were found. Composite haplotype of 16S rDNA could differentiate H. asinina, H. ovina and H. varia unambiguously. In addition, differentiation of H. ovina from the Andaman Sea (ABBB) and the Gulf of Thailand (AAAB and AABB) could also be carried out by PCR-RFLP of 16S rDNA. A UPGMA dendogram constructed from genetic distance between pairs of composite haplotypes revealed reproductively isolated gene pools of these abalone and indicated that H. asinina and H. ovina are genetically closer than H. varia. Disregarding H. varia due to small sample sizes, geographic heterogeneity analysis and FST estimate indicated clear genetic differentiation between H. ovina originating from the Andaman Sea (west) and the Gulf of Thailand (east, P < 0.0001) whereas partial differentiation was observed between the Philippines and the remaining H. asinina samples (P < 0.0021). Genetic diversity and population differentiation of the tropical abalone (H. asinina) were also analysed RAPD-PCR. Based on restriction analysis, a lack of population differentiation was observed between natural H. asinina samples in coastal Thai waters (P > 0.0083). Conversely, RAPD analysis using primers OPB11, UBC101, UBC195, UBC197 and UBC271 illustrated significant differentiation between natural H. asinina from the Andaman Sea (HATRAW) and the Gulf of Thailand (HASAME and HACAME) (P < 0.0001). Three partial genomic libraries were constructed from Alu I-digested, vortexed/sonicated and mixed enzyme (Alu I, Hinc II and Rsa I) digested genomic DNA of H. asinina and yielded the percentage of microsatellite containing clones of 0.20%, 0.42% and 1.46%, respectively. Eleven clones each of perfect, imperfect and compound microsatellites were isolated. Ten locus-specific primer pairs (Has1 - Has10) were analyzed to evaluate their polymorphic levels. The numbers of alleles per locus, observed (Ho) and expected (He) heterozygosity were 3 - 26 alleles, 0.27 - 0.85 and 0.24 – 0.93, respectively. Three microsatellite loci (Has2, Has3 and Has8) were further used for examination of genetic diversity and differentiation of natural H. asinina in coastal waters of Thailand. The effective number of alleles (ne), Ho and He of HACAME (9.37, 0.62 and 0.88) and HASAME (7.66, 0.78 and 0.86) from the Gulf of Thailand were greater than those of HATRAW (6.04, 0.58 and 0.62) viii from the Andaman Sea. Genetic heterogeneity and FST analyses indicated intraspecific population differentiation between natural H. asinina from the Gulf of Thailand (HASAME and HACAME) and the Andaman Sea (HATRAW) samples (P < 0.0001). For development of species-specific markers, the amplified 16S rDNA of individuals representing composite haplotypes found in this study (AAAA, AAAE in H. asinina; AAAB, AABB and ABBB in H. ovina and AABC, BABC, BABD, BABF and BABG in H. varia) was cloned and sequenced. A neighbor-joining tree constructed from sequence divergence of 16S rDNA allocated those sequences according to species origins of abalone accurately. Species-specific PCR based on 16S rDNA polymorphism was successfully developed in H. asinina and H. varia but not in H. ovina. The sensitivity of detection was approximately 25 pg and 50 pg for DNA template of H. asinina and H. varia, respectively. Species- and population-specific markers of abalone; Haliotis asinina, H. ovina, and H. varia in Thai waters were also identified based on RAPD analysis. Fifteen species-specific and six population-specific RAPD markers and a 1650 bp band (UBC195) restricted to H. ovina from the Gulf of Thailand (east) was found. All specific RAPD markers were cloned and sequenced. Twenty pairs of primers were designed and specificity-tested (N = 12 and 4 for target and non-target species, respectively). Seven primer pairs (CUHA1, CUHA2, CUHA4, CUHA11, CUHA12, CUHA13 and CUHA14) were specifically amplified H. asinina DNA whereas a single pair of primers showed specificity with H. ovina (CUHO3) and H. varia (CUHV1), respectively. Five primer pairs including CUHA2, CUHA12, CUHA13, CUHO3 and CUHV1 were further examined against 216 individuals of abalone (N = 111, 73 and 32, respectively). Results indicated species-specific nature of all except CUHO3 with the sensitivity of detection of 100 pg and 20 pg of the target DNA template for CUHA2 and CUHA12 and CUHV1, respectively. The species-origin of frozen, ethanol-preserved, dried and boiled H. asinina specimens could be successfully identified by CUHA2. CHHA12 and CUHA13.