Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2012

การทดลองที่ 1 ศึกษาหาวิธีการที่เหมาะสมของการปรับปรุงเซลล์ต้นกำเนิด โดยวิธีการเหนี่ยวนำเซลล์ให้อยู่ในระยะพักด้วยวิธีการต่างๆ เซลล์ไฟโบรบลาสท์ที่ได้จากผิวหนังของแมวบ้านสามารถถูกเหนี่ยวนำให้อยู่ในระยะพักได้หลายวิธี ทั้งวิธีการลดปริมาณซีรัมในน้ำยาเลี้ยงเซลล์ลงเป็นเวลา 3 วัน การเลี้ยงเซลล์ให้มีความหนาแน่นร้อยละ 100 การใช้โรสโควิทีนที่ความเข้มข้น 15 ไมโครโมลาร์ แต่วิธีการลดปริมาณซีรัมนั้นสามารถทำให้เกิดเซลล์ตายที่ค่อนข้างมากเมื่อเทียบกับวิธีอื่นๆ ดังนั้นวิธีการที่เหมาะสมที่สุดในการปรับปรุงเซลล์แมวต้นกำเนิดในการศึกษานี้คือ การเลี้ยงเซลล์ให้มีความหนาแน่นร้อยละ 100 เป็นเวลา 5 วัน หรือการใช้โรสโควิทีนที่ความเข้มข้น 15 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง การทดลองที่ 2 การศึกษาแรกเพื่อสังเกตการพัฒนาของตัวอ่อนโคลนแมว จากการย้ายฝากนิวเคลียสแบบข้ามสปีชีส์โดยใช้โอโอไซต์ของโคเป็นตัวรับและใช้เซลล์แมวต้นกำเนิดที่ได้รับการปรุงปรุงด้วยวิธีการเลี้ยงให้มีความหนาแน่นร้อยละ 100 เป็นเวลา 5 วัน หรือการใช้โรสโควิทีนที่ ความเข้มข้น 15 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ประสิทธิภาพเชื่อมติดของเซลล์แมวที่ได้จากการใช้โรสโควิทีนและโอโอไซต์ของโคสูงกว่าในกลุ่มของตัวอ่อนที่ใช้เซลล์แมวจากการเลี้ยงเซลล์ให้มีความหนาแน่นร้อยละ 100 อย่างมีนัยสำคัญ (77.3 และ 57.9%, P<0.05) แต่อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองกลุ่มการทดลอง ตัวอ่อนโคลนแมวแบบข้ามสปีชีส์ส่วนมากหยุดการพัฒนาที่ระยะ 2-4 เซลล์ และไม่มีตัวอ่อนใดเลยที่สามารถพัฒนาไปจนถึงระยะโมรูลาและบลาสโตซิส การศึกษาที่สองเพื่อศึกษาการพัฒนาของตัวอ่อนโคลนแมวแบบข้ามสปีชีส์ที่มีการปรับปรุงกระบวนการเลี้ยงโดยการเติมสารทริโคสแตตินเอเพื่อปรับอิพิเจเนติกส์ที่ความเข้มข้นต่างๆ เป็นเวลา 24 ชั่วโมงภายหลังการเชื่อมติดเซลล์ การเติมสารทริโคสแตตินเอที่ความเข้มข้น 50 นาโนโมลาร์ช่วยเพิ่มร้อยละของการแบ่งตัวและการพัฒนาของตัวอ่อนไปยังระยะบลาสโตซิส (84.3 และ 4..6%, P<0.05) เมื่อเทียบกับกลุ่มการควบคุม (63.8 และ 0%, P<0.05) และกลุ่มที่มีการเติมสารทริโคสแตตินเอที่ความเข้มข้น 100 นาโนโมลาร์อย่างมีนัยสำคัญ (71.4 และ 0%, P<0.05) การทดลองที่ 3 ศึกษารูปแบบของการเกิดอะเซทิลเลชั่นหรือเมทิลเลชั่นบนโปรตีนฮีสโตนของเซลล์ต้นกำเนิดแมวและตัวอ่อนโคลนแมวแบบข้ามสปีชีส์ระหว่างกลุ่มที่มีการเติมสารทริโคสแตตินเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การเกิดอะเซทิลเลชั่นบนโปรตีนฮีสโตนที่ตำแหน่งไลซีน 9, 18 และ 23 ของเซลล์ต้นกำเนิดในกลุ่มที่มีการเติมสารทริโคสแตตินเอมีระดับสูงกว่าในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ระดับของโปรตีนฮีโตนไม่แตกต่างกันระหว่างกลุ่มทดลอง เช่นเดียวกับตัวอ่อนโคลนแมวข้ามสปีชีส์ ในกลุ่มที่มีการเติมสารทริโคสแตตินเอเป็นเวลา 24 ชั่วโมงภายหลังการเชื่อมติดเซลล์มีระดับการเกิดอะเซทิลเลชั่นบนโปรตีนฮีสโตนที่ตำแหน่งไลซีน 9, 18 และ 23 ที่สูงกว่ากลุ่มควบคุมในตัวอ่อนระยะภายหลังการเชื่อมติดเซลล์ 2 ชั่วโมง ระยะโปรนิวเคลียส ระยะ 2 เซลล์ ระยะ 4 เซลล์ และระยะ 8 เซลล์ อย่างมีนัยสำคัญ ยกเว้นในตัวอ่อนระยะภายหลังการเชื่อมติดเซลล์ 6 ชั่วโมง ที่ระดับของการเกิดอะเซทิลเลชั่นบนโปรตีนฮีสโตนที่ตำแหน่งไลซีน 9 และ 23 ต่ำกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ ในระยะโปรนิวเคลียส ตัวอ่อนในกลุ่มที่มีการเติมสารทริโคสแตตินเอแสดงการเกิดเมทิลเลชั่นบนโปรตีนฮีสโตนที่ตำแหน่งไลซีน 9 ที่สูงกว่าตัวอ่อนกลุ่มควบคุม ซึ่งรูปแบบการเกิดอะเซทิลเลชั่นและเมทิลเลชั่นดังกล่าวของกลุ่มที่มีการเติมสารทริโคสแตตินเอมีความคล้ายคลึงกับตัวอ่อนโคที่เกิดจากกระบวนการปฏิสนธิภายนอกร่างกาย การทดลองที่ 4 ศึกษาการพัฒนาภายนอกร่างกายของตัวอ่อนโคลนแมวข้ามสปีชีส์ที่มีการปรับปรุงระบบการเลี้ยงโดยการเติมสารทริโคสแตตินเอที่ความเข้มข้น 50 นาโนโมลาร์ โดยการย้ายฝากตัวอ่อนที่มีการแบ่งตัวที่ระยะ 2-4เซลล์จำนวนทั้งหมด 224 ตัวอ่อน สู่แมวตัวรับ 5 ตัว อย่างไรก็ตามไม่มีแมวตัวรับใดตั้งท้อง ภายหลังการตรวจด้วยอัลตร้าซาวน์ในวันที่ 30 หลังการย้ายฝาก สรุปว่าตัวอ่อนโคลนแมวข้ามสปีชีส์สามารถพัฒนาไปถึงระยะบลาสโตซิสได้ ภายหลังการปรับปรุงระบบการเลี้ยงด้วยการเติมสารปรับอิพิเจเนติกส์ทริโคสแตตินเอที่ความเข้มข้น 50 นาโนโมลาร์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ภายหลังการเชื่อมติดเซลล์ ซึ่งสารดังกล่าวมีความสามารภในการปรับรูปแบบอิพิเจเนติกส์ให้มีความใกล้เคียงกับตัวอ่อนที่เกิดจากการปฏิสนธิภายนอกร่างกาย อย่างไรก็ตามตัวอ่อนที่ได้รับการรักษาด้วยสารดังกล่าวไม่สามารถพัฒนาต่อภายหลังการย้ายฝากสู่แม่ตัวรับ