ปัจจุบันมาลาเรียยังเป็นโรคติดเชื้อที่เป็นปัญหาทางสาธารณสุขที่สำคัญ ก่อให้เกิดอาการอย่าง รุนแรงในคน และทำให้คนติดเชื้อทั่วโลกปีละถึง 500 ล้านคนและเสียชีวิตลงปีละ 1.5-2.7 ล้านคน การ ควบคุมโรคมาลาเรียทำได้ลำบากขึ้นจากการแพร่ระบาดของเชื้อที่ดื้อต่อยาที่ใช้ในการรักษาและจากการ พัฒนาและระบาดของยุงก้นปล่องที่ดื้อต่อยาฆ่าแมลง รวมทั้งการที่ยังไม่มีวัคซีนมาใช้ป้องกันโรค จึงเป็น สถานการณ์เร่งด่วนที่จะต้องพัฒนายารักษามาลาเรียชนิดใหม่ โดยอาศัยตำแหน่งเป้าหมายที่ได้จาก โครงการจีโนม และความรู้ที่สะสมต่อเนื่องกันมานานหลายสิบปี ถึงกระนั้นความรู้ทางชีวเคมีของเชื้อ มาลาเรียยังไม่กระจ่างนัก โดยเฉพาะการสังเคราะห์เบสไพริมิดีนซึ่งเป็นสารตั้งต้นในกระบวนการ สังเคราะห์สารพันธุกรรมของเชื้อมาลาเรีย ในชุดโครงการวิจัยนี้ได้สร้างองค์ความรู้เกี่ยวกับชีวเคมีและอณูชีววิทยาของวิถีการสังเคราะห์เบส ไพริมิดีนในเชื้อมาลาเรียของคน ทำให้มีความเข้าใจอย่างถ่องแท้ถึงยีนส์และเอนไซม์ 2 ชนิดคือ ออโร เทท ฟอสโฟไรโบสีลทรานซ์เฟอเรส (OPRT) และ ออโรทิไดเลท ดีคาร์บอกซีลเลส (OMPDC) โดยได้ ทำการแยกเอนไซม์ทั้งสองออกมาได้อย่างบริสุทธิ์จากเชื้อมาลาเรียของคนที่เพาะเลี้ยงได้มากพอในห้อง เพาะเชื้อ พบมีคุณสมบัติจำเพาะโดยเอนไซม์ทั้งสองมารวมอยู่ด้วยกันซึ่งแต่ละเอนไซม์มีน้ำหนักโมเลกุล เหมือนกับที่ได้คาดการณ์ไว้ในฐานข้อมูลจีโนมของเชื้อ คุณสมบัติจำเพาะที่มารวมกันอยู่ของเอนไซม์ OPRT และ OMPDC เป็นการค้นพบเป็นครั้งแรกของเอนไซม์สองชนิดนี้ คุณสมบัติอื่นๆ อาทิเช่น ค่า จลนศาสตร์แสดงประสิทธิภาพของเอนไซม์ การใช้ตัวยับยั้งที่มีต่อเอนไซม์ทั้งสอง รวมทั้งได้ศึกษาเปรียบ เทียบกับเอนไซม์ของคนที่มีการศึกษาไว้ก่อนหน้านี้แล้ว พบว่ามีคุณสมบัติแตกต่างกันระหว่างเอนไซม์นี้ ในเชื้อมาลาเรียและในคนอย่างสิ้นเชิง ได้ทำการโคลนยีนส์ OPRT และ OMPDC ของเชื้อมาลาเรียของคน แล้วนำไปแสดงออกของ ยีนในแบคทีเรียอีโคไล การแยกเอนไซม์รีคอมบิแนนท์ให้บริสุทธิ์ เอนไซม์ที่ได้ทำงานมีประสิทธิภาพสูง จึงศึกษาคุณสมบัติอย่างละเอียดทั้งในแง่จลนศาสตร์ กลไกการเร่งปฏิกิริยา รวมทั้งการใช้สารยับยั้ง เอนไซม์ รวมทั้งนำเอนไซม์ที่บริสุทธิ์ทั้ง 2 ชนิดมารวมกันในหลอดทดลองโดยสภาพจำลองให้เหมือนกับ เอนไซม์อยู่ในตัวเชื้อมาลาเรีย พบว่าเอนไซม์ทั้งสองมารวมกันได้และเกิดประสิทธิภาพของการเร่ง ปฏิกิริยาได้ดีกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์แต่ละชนิดที่ไม่ได้นำมารวมกัน และผลการรวมกันได้คุณ สมบัติของเอนไซม์เหมือนกับที่ศึกษาที่แยกได้โดยตรงจากตัวเชื้อมาลาเรีย ได้วิเคราะห์จลนศาสตร์ของ การรวมกันของเอนไซม์ทั้งสอง พบว่าเอนไซม์แต่ละชนิดจะรวมกันเองก่อนเป็นคู่ แล้วนำคู่ของเอนไซม์ทั้ง สองมารวมกันอย่างละคู่ ได้ผลเป็นเอนไซม์คู่ผสม นอกจากนี้ตัวยับยั้งยังจับเอนไซม์คู่ผสมได้ดีกว่าเมื่อ เปรียบเทียบกับเอนไซม์ที่แยกกันอยู่ ตัวยับยั้งการทำงานของเอนไซม์มีฤทธิ์ต้านการเจริญเติบโตของเชื้อ มาลาเรียของคนได้ดี ได้เสนอว่าเอนไซม์ที่ศึกษาทั้งสองชนิดอาจจะเป็นตำแหน่งเป้าหมายใหม่ในการพัฒนายารักษา มาลาเรีย และควรศึกษาเอนไซม์ที่ใช้ในการสังเคราะห์สารไพริมิดีนให้ครบทั้งระดับยีนส์และโปรตีนเหล่านี้ เพื่อสร้างองค์ความรู้นำไปใช้ออกแบบและพัฒนายารักษามาลาเรียตัวใหม่โดยมีตำแหน่งเป้าหมายที่การ สังเคราะห์เบสไพริมิดีนในเชื้อมาลาเรีย คุณสมบัติจำเพาะของเอนไซม์ในเชื้อมาลาเรียน่าจะมีความ สำคัญในแง่การเกิดวิวัฒนาการของเอนไซม์ทั้งสองที่พบในเซลล์ของสัตว์ชั้นต่ำและชั้นสูงรวมทั้งสัตว์เลี้ยง ลูกด้วยนม นอกจากนี้ความสำคัญในการควบคุมการทำงานของเอนไซม์ทั้งสองคงต้องศึกษาวิจัยต่อไป ผลงานวิจัยในช่วงเวลา 3 ปีที่ได้รับทุนสนับสนุน มีผลงานได้รับการตีพิมพ์จำนวน 4 ผลงานใน วารสารนานาชาติ [1). Biochemistry 2005, impact factor = 4.008; 2). Biochem Biophys Res Commun 2004, impact factor = 2.904; 3). Mol Biochem Parasitol 2004, impact factor = 2.803; 4). SE Asian J Trop Med Public Health 2003] รวมทั้งได้รับเชิญไปบรรยายเกี่ยวกับผลงานวิจัยดังกล่าว 3 ครั้ง [1). International Tropical Medicine Meeting 2002; 2). Florence University 2003; 3). International Conference on the Carbonic Anhydrases 2003] Malaria remains one of the world’s major public health problems with 500 million infected patients annually. Plasmodium falciparum, the etiologic agent of the most lethal and severe form, is responsible for 1.5-2.7 million deaths per year. Chemotherapy of malaria is available but it is complicated both drug toxicity and widespread drug resistance. The need for more efficacious and less toxic agents, particularly rational drugs that exploit pathways and targets unique to the parasite, is therefore acute. The project is performed to better understanding in biochemistry and molecular biology of the de novo pyrimidine biosynthetic pathway in human malaria parasite with the goal of illuminating new chemotherapeutic targets for drug development. Since the parasite depends on the de novo biosynthetic pathway for pyrimidines, precursors for DNA and RNA. Thus, inhibitors of the malarial pathway could be effective antimalarial agents. We have exploited the unique metabolic features of P. falciparum by identification and characterization of two enzymes and their genes of the pyrimidine pathway, orotate phosphoribosyltransferase (OPRT) and orotidylate decarboxylase (OMPDC), in asexual stage of the human parasite taken from in vitro culture. They are then purified and found to be an multienzyme complex. This is the first evidence to illustrate the malarial enzymes OPRT and OMPDC behaving the enzyme complex formation, which is not found in the analogous enzymes of other organisms so far studied. The physical and kinetic properties are well characterized. Molecular masses of both enzymes are determined and similar to their expected sizes in the malarial genome database. Some types of compounds are found to be inhibitors of the enzymes. We have cloned the full-length open reading frame of both genes in P. falciparum, including gene isolation, sequencing and characterization. The cloned genes are functionally expressed as soluble proteins in a bacterial Escherichia coli. The recombinant proteins are then purified and found to have high catalytic efficiency. Detailed analyses on kinetic, catalytic and inhibitory properties, and the in vitro re-association of both recombinant enzymes are then performed. The enzyme complex formation can occur and both enzymes in the complex show more both catalytic efficiency and sensitive to the inhibitors than the individual enzyme. They also have similar kinetic properties to those of the multienzyme complex purified directly from the parasite. The kinetic behaviors of the complex formation are as follows: 1) the monofunctional enzyme forms dimer; 2) the individual dimeric enzyme associates into a heteroterameric complex. Furthermore, their inhibitors have antimalarial activity on the in vitro growth of the human parasite. Our results of the project suggest that: 1) the enzymes have unique properties as they may be a borderline between prokaryotes and eukaryotes, 2) they may play role in regulation of the pyrimidine pathway, 3) they are vital for the parasite survival, and 4) they may represent a putative chemotherapeutic target for drug development. The outputs of the 3-year funding project are as follows: 1.There are 4 publications in international journals, these include: 1. Biochemistry 2005, impact factor = 4.008; 2. Biochem Biophys Res Commun 2004, impact factor = 2.904; 3. Mol Biochem Parasitol 2004, impact factor = 2.803; 4. SE Asian J Trop Med Public Health 2003. 2. There are 3 invited presentation and lecture, these include: 1. International Tropical Medicine Meeting 2002; 2. Florence University 2003; 3. International Conference on the Carbonic Anhydrases 2003.