พยาธิตัวจี๊ด Gnathostoma spinigerum เป็นเชื้อที่ก่อให้เกิดโรคพยาธิตัวจี๊ดในคน (human gnathostomiasis) ซึ่งเป็นโรคติดเชื้อปรสิตที่เกิดขึ้นบริเวณผิวหนังและอวัยวะภายใน รวมถึงระบบ ประสาทส่วนกลาง cysteine และ serine proteases ในปรสิตหลายชนิด มีบทบาทอย่างมากต่อกลไก การอยู่ร่วมกันแบบปรสิต ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ทำการแยก cDNA ที่กำหนดการสร้าง cathepsin Llike cysteine protease (GsCL1) และ serine protease (GsSP1) จากตัวอ่อนระยะที่ 3 ขั้นปลายของ พยาธิตัวจี๊ด (aL3) และได้ศึกษาคุณลักษณะทางชีวเคมีของ recombinant enzymes ความยาวที่ สมบูรณ์ของ cDNA ของยีน GsCL1 คือ 1,484 bp ซึ่งกำหนดการสร้างโปรตีนที่มีขนาดกรดอะมิโน ยาว 398 ตัว ซึ่งประกอบด้วย signal peptide, pro-domain และ mature domain ที่มีกรดอะมิโนจำนวน 23, 156 และ 219 ตัวตามลำดับ mature enzyme มีมวลโมเลกุล 24 kDa ลำดับกรดอะมิโนของ GsCL1 ประกอบด้วย cysteine protease catalytic triad (Cys25, His165 และ Asn186), ERFNIN motif ที่มี ลักษณะคงไว้ และ GNFD motif ซึ่งอาจเกี่ยวข้องในกระบวนการภายในโมเลกุลของเอนไซม์ ลำดับ กรดอะมิโนของ GsCL1 มีความเหมือน 53-64% กับ cathepsin L proteases ของสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ รวมถึง cathepsin L (cpl-1) ของ Caenorhabditis elegans การวิเคราะห์ทาง phylogenetic กับสมาชิกใน papain superfamily 24 ชนิด แสดงให้เห็นว่า GsCL1 มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ cathepsin L proteases ของพยาธิตัวกลม รวมถึง C. elegans ด้วย recombinant pro-enzyme ของ GsCL1 ที่ถูก สร้างขึ้นใน Pichia pastoris มีปฏิกิริยาต่อ Z-Phe-Arg-AMC substrate ได้ดีที่สุดที่ pH 6.0 ซึ่งปฏิกิริยา นี้ถูกยับยั้งได้ด้วย cysteine protease inhibitors E-64 และ K11777 GsCL1 มีความชอบกรดอะมิโน ที่เป็น hydrophobic ขนาดใหญ่ และ aromatic (Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Tyr) ที่ตำแหน่ง P2 ซึ่งเป็น ลักษณะเฉพาะของ cathepsin L proteases ซีรั่มหนูต่อ GST-proGsCL1 ทำปฏิกิริยากับโปรตีน ขนาด 35, 38 และ 45 kDa ที่สกัดจาก aL3 และพบว่าโปรตีนเหล่านี้อยู่ในเซลล์ลำไส้ของ aL3โดยวิธี immunofluorescence cDNA ของยีน GsSP1 ขนาด 1,032 bp กำหนดการสร้างโปรตีนที่มีกรดอะมิโนยาว 343 ตัว ซึ่งประกอบด้วย putative signal peptide, activation peptide และ mature enzyme ที่มีกรดอะมิโน จำนวน 19, 26 และ 298 ตัว ตามลำดับ mature enzyme มีมวลโมเลกุล 32.9 kDa และประกอบด้วย serine protease catalytic triad (His46, Asp95 และ Ser196) ลำดับกรดอะมิโนมีความเหมือน 30-35% กับ serine proteases ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม แมลง และ eukaryotes ชนิดอื่น ๆ การวิเคราะห์ทาง phylogenetic กับสมาชิกของ serine proteases ที่คัดเลือกมาแสดงให้เห็นว่า GsSP1 มีความเกี่ยวข้อง อย่างใกล้ชิดกับ serine proteases ของแมลงและผีเสื้อกลางคืนมากกว่า serine proteases ของสัตว์เลี้ยง ลูกด้วยนม recombinant pro-enzyme ของ GsSP1 ที่ถูกสร้างขึ้นใน P. pastoris ไม่มีปฏิกิริยาต่อ fluorogenic substrates ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ซีรั่มหนูต่อ GST-proGsSP1 fusion protein ทำ ปฏิกิริยากับโปรตีนขนาด 35, 38 และ 39 kDa ที่สกัดจาก aL3 พบว่าโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ GsSP1 เหล่านี้อยู่ในเซลล์ลำไส้ของ aL3 เช่นเดียวกันกับ GsCL1 จากผลการทดลองนี้บอกเป็นนัยถึง บทบาทของเอนไซม์โพรทีเอสในการย่อยสลายโปรตีนที่ตัวอ่อนพยาธิกินเข้าไป อย่างไรก็ตาม หน้าที่ที่แน่ชัดของ cysteine และ serine proteases ของพยาธิตัวจี๊ดยังคงต้องมีการศึกษาต่อไป Gnathostoma spinigerum is a causative agent of human gnathostomiasis, a common parasitic disease involving skin and visceral organs, especially the central nervous system. Cysteine and serine proteases of many parasites have been demonstrated to play several roles in the mechanisms of parasitism. In this study, cDNA encoding a cathepsin L-like cysteine protease (GsCL1) and a serine protease (GsSP1) from G. spinigerum advanced third-stage larva (aL3) were identified and the biochemical properties of the recombinant enzymes characterized. The complete cDNA of the GsCL1 gene of 1,484 bp encodes a protein of 398 amino acids consisting of the typical signal peptide sequence, the pro-domain and the mature domain of 23, 156 and 219 amino acids, respectively. The mature enzyme has the predicted molecular mass of 24 kDa. The amino acid sequence of GsCL1 contains the cysteine protease catalytic triad, Cys25, His165, and Asn186, a highly conserved ERFNIN motif and a GNFD motif, which may be involved in intramolecular processing of the enzyme. The deduced amino acid sequence of GsCL1 gene shows 53-64% identity to cathepsin L proteases of various organisms including a cathepsin L family member (cpl-1) of Caenorhabditis elegans. Phylogenetic analysis with 24 members of the papain superfamily has revealed that GsCL1 is more closely related to cathepsin L proteases of nematodes including C. elegans. The recombinant pro-enzyme of GsCL1 expressed in Pichia pastoris displayed optimal protease activity toward Z-Phe-Arg-AMC substrate at pH 6.0. The activity was sensitive to cysteine protease inhibitors E-64 and K11777. The preference of GsCL1 for large hydrophobic and aromatic residues in the P2 position (Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Tyr) was typical of cathepsin L proteases. Mouse anti-GST-proGsCL1 serum showed reactivities with 35-, 38- and 45-kDa proteins in the aL3 extracts. These proteins were shown to localize inside the intestinal cells of aL3 by immunofluorescence assay. The 1,032-bp cDNA sequence of the GsSP1 gene encodes a protein of 343 amino acids comprising the putative signal peptide, the activation peptide and the mature enzyme of 19, 26 and 298 amino acids, respectively. The mature enzyme has the predicted molecular mass of 32.9 kDa and contains the serine protease catalytic iv triad, His46, Asp95, and Ser196. The deduced amino acid sequence shows 30-35% homology to serine proteases from mammalians, insects and other eukaryotes. Phylogenetic analysis with selected members of serine proteases has revealed that GsSP1 is more closely related to those of insects and moths than those of mammalians. The recombinant proGsSP1 expressed in P. pastoris showed no serine protease activity against the fluorogenic substrates used in this study. Mouse antiserum against GSTproGsSP1 fusion protein reacted with 35-, 38- and 39-kDa proteins in the aL3 extracts. These GsSP1-related proteins, similar to that seen with GsCL1, were shown to reside in the intestinal cells of aL3 by immunofluorescence assay. These results suggest their role in the degradation of the proteins ingested by the larva. However, the exact function of G. spinigerum cysteine and serine proteases remains to be determined.