เทคโนโลยี RNAi เป็นเทคนิคหนึ่งที่ได้รับความนิยมในการศึกษาหน้าที่ของยีนในสิ่งมีชีวิตทั้งพืชและสัตว์ งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อดัดแปลงพลาสมิดให้บรรจุลำดับเบสซ้ำแบบย้อนกลับ (Inverted repeat sequences) ที่สามารถกระตุ้นกระบวนการ RNAi โดยไปยับยั้งการแสดงออกของยีน เพื่อศึกษาหน้าที่ของยีนที่ตอบสนองต่อความเครียดเกลือในข้าว ซีดีเอ็นเอโคลนจำนวน 4 จากทั้งหมด 11 โคลนที่ตอบสนองต่อความเครียดเกลือที่ได้จากการศึกษาก่อนหน้านี้ ได้แก่ โคลน 89, 162, 380.3 และ 380.5 มาวิเคราะห์เปรียบเทียบลำดับซีดีเอ็นเอกับฐานข้อมูล NCBI จากนั้นนำข้อมูลลำดับซีดีเอ็นเอรหัส CI081889.1, NM_001065599.1, AP008207.1 และ NM_001051327 เป็นตัวแทนของลำดับซีดีเอ็นเอโคลน 89, 162, 380.3 และ 380.5 ตามลำดับ ทำการออกแบบไพรเมอร์แบบจำเพาะโดยกำหนดผลผลิตขนาดประมาณ 300 คู่เบส ทำการดัดแปลงเวกเตอร์ให้อยู่ในรูปแบบ RNAi โดยเริ่มจากการโคลนชิ้นส่วนซีดีเอ็นเอของแต่ละโคลนที่เพิ่มปริมาณได้จากปฏิกิริยา RT-PCR เข้าสู่พลาสมิด pENTR-TOPO/D พบว่า สามารถโคลนได้เฉพาะชิ้นส่วนซีดีเอ็นเอของโคลน 380.3 โดยมีขนาดถูกต้องและมีลำดับเบสครบสมบูรณ์ จากนั้นจึงทำปฏิกิริยาแลกเปลี่ยนชิ้นส่วนซีดีเอ็นเอของโคลน 380.3 ในพลาสมิด pENTR-TOPO/D เข้าสู่พลาสมิด pANDA เพื่อสร้างลำดับเบสซ้ำแบบย้อนกลับ ก่อนที่จะส่งถ่ายเข้าสู่เชื้ออะโกรแบคทีเรียมสายพันธุ์ LBA4404 โดยวิธี Electroporation ยืนยันผลการส่งถ่ายโดยใช้อาหารคัดเลือกที่มียาปฏิชีวนะไอโกรมัยซินและตรวจสอบขนาดและทิศทางการแทรกตัวของชิ้นดีเอ็นเอโดยปฏิกิริยาพีซีอาร์ ทำการส่งถ่ายยีนรูปแบบ RNAi เข้าสู่แคลลัสข้าวขาวดอกมะลิ 105 โดยวิธี Agrobacterium-mediated transformation คัดเลือกแคลลัสที่ได้รับการส่งถ่ายยีนบนอาหารคัดเลือกสูตร N6 ดัดแปลงที่มีการเติมยาปฏิชีวนะไฮโกรมัยซินเข้มข้น 30 มิลลิกรัมต่อลิตร พบแคลลัสที่สามารถเจริญได้บนอาหารคัดเลือกจำนวน 54 แคลลัส (19.01%) ยืนยันว่ามีแคลลัสที่รับเอา T-DNA จากพลาสมิด pANDA ดัดแปลงซึ่งมียีน hpt เข้าสู่แคลลัสดังกล่าว และมีแคลลัสบางชิ้นที่สามารถชักนำให้เกิดต้นอ่อนได้ อย่างไรก็ตาม งานวิจัยนี้ยังต้องทำการตรวจสอบว่ามีการยับยั้งการแสดงออกของยีนโดยกลไก RNAi ในข้าวแปลงพันธุ์จริงและการทดสอบความสามารถในการทนเค็มระหว่างข้าวปกติและข้าวแปลงพันธุ์ RNAi เพื่อศึกษาว่าโคลน 380.3 มีผลต่อกลไกการทนเค็มในข้าวอย่างไร RNAi technology is one of the most popular techniques to study gene function in plants and animals. This study focused on using RNAi technology for functional analysis of salt-stress responsive genes to understand the mechanism of salt-stress tolerance in rice. Four out of 11 salt-stress responsive cDNA clones from a previous report were selected and compared their sequences with the GenBank Database. Rice sequences accession no. CI081889.1, NM_001065599.1, AP008207.1 and NM_001051327 were selected as representatives for clone 89, 162, 380.3 and 380.5, respectively. Then primers specific to these clones were designed by Primer 3 program to obtain the PCR products, approximately 300 bp in size. To determine the function of salt-stress responsive genes using RNAi technique, RNAi vector containing an Inverted Repeat (IR) sequence needed to be constructed. First, a cDNA fragment of each clones obtained by RT-PCR was cloned into pENTR-TOPO/D entry plasmid for amplification. The result showed that only a cDNA fragment of clone no. 380.3 has been inserted in pENTR-TOPO/D with the right size and in the correct sequence. The LR recombination reaction was then performed for subcloning sequences of cDNA clone no. 380.3 into pANDA destination vector to obtain an IR sequence before electroporation into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404. Agrobacterium-mediated transformation was carried out using 3 weeks-old rice calli incubated with A. tumefaciens strain LBA4404 harboring a modified pANDA plasmid. Transformed calli were selected on modify N6 medium supplemented with 30 mg/l hygromycin. Fifty-four calli were able to grow on selective medium, 19.01%, indicating that these calli have accepted T-DNA region of the modify pANDA plasmid containing the hpt gene. In addition, a few calli were able to be induced into shoot. However, the examination of gene silencing to confirm the occurrence of RNAi phenomenon in the transgenic plants and salt stress test between non-transgenic and RNAi plants needs to be investigated in the future.