งานวิจัยชิ้นนี้มีจุดประสงค์ที่จะเรียนรู้ถึงกลไกในการควบคุมแรงดันออสโมติกในไซยาโน แบคทีเรียมชนิดชอบความเค็ม อะฟาโนทีคี ฮาโลฟิทิคา ซึ่งมีคุณลักษณะที่เป็นประโยชน์ในการ ศึกษาเนื่องจากมันสามารถเจริญได้ในช่วงความเค็มตั้งแต่ 0.25 ถึง 3 โมลาร์ ของเกลือโซเดียมคลอ ไรด์ กลไกอันหนึ่งที่สิ่งมีชีวิตหลาย ๆ ประเภทใช้ในการปรับแรงดันออสโมติก ได้แก่ การสร้างและ สะสมสารประกอบที่ไม่เป็นอันตรายต่อเซลล์ ซึ่งเราเรียกสารประกอบชนิดนี้เป็น คอมแพททิเบิล หรือออสโมโปรเทคแทนท์โซลูท เพื่อที่จะทำงานวิจัยชิ้นนี้ให้เป็นระบบ จึงได้แบ่งรูปแบบของการศึกษาการสังเคราะห์คอม แพททิเบิลโซลูทที่มีชื่อว่า ไกลซีนบีเทน ออกเป็น 3 ส่วนดังนี้ 1 สภาวะที่ทำให้เซลล์สะสมไกลซีนบีเทน ผลการทดลองพบว่า ความเค็มสูง ๆ หรือใส่สารที่ เพิ่มแรงดันภายนอกเซลล์ เช่น ซอร์บิทอล จะช่วยกระตุ้นให้เกิดการสะสมไกลซีนบีเทนขึ้นมากภาย ในเซลล์ นอกจากนี้การใส่โซเดียมไนเตรทลงในสารอาหาร หรือแม้กระทั่งการให้แสงสว่างขณะกำลัง เลี้ยงเซลล์ก็จะทำให้เซลล์ที่เลี้ยงภายใต้สภาวะความเครียดของเกลือเท่านั้นที่จะมีการสะสมไกลซีนบี เทนเพิ่มขึ้น 2 วิถีการสังเคราะห์ไกลซีนบีเทน จากการทดลองโดยวิธี เรดิโอเทรเซอร์ พบว่าวิถีการ สังเคราะห์น่าจะเป็นดังนี้; โคลีน ? บีเทนอัลดีฮายด์ ? ไกลซีนบีเทน ข้อมูลเพิ่มเติมที่สนับสนุน การทำงานของวิถีการสังเคราะห์อันนี้ได้จากผลการทดลองที่แสดงถึงการทำงานของเอนไซม์ที่เกี่ยว ข้องในขั้นตอนที่ 1 และที่ 2 กล่าวคือ สามารถตรวจพบแอคติวิตีของเอนไซม์โคลีนและบีเทนอัลดี ฮายด์ ดีไฮโดรจีเนสได้ในส่วนของเม็มเบรนและส่วนของไซโตปลาสมตามลำดับ และยังพบอีกว่า ความเค็มภายนอกที่สูงขึ้นจะทำให้เอนไซม์ทั้ง 2 ตัว ดังกล่าวมีแอคติวิตีเพิ่มขึ้น ซึ่งสอดคล้องกับผล ที่แสดงว่าการเพิ่มขึ้นของความเค็มภายนอกเซลล์ช่วยกระตุ้นให้เซลล์สังเคราะห์ไกลซีนบีเทนได้ดี ขึ้น นอกจากนี้ข้อมูลเบื้องต้นบ่งชี้ว่าไม่เพียงแต่โคลีนเท่านั้นที่สามารถเปลี่ยนไปเป็นไกลซีนบีเทน เซลล์สามารถที่จะใช้เอธานอลามีนหรือไกลซีนในการสังเคราะห์ไกลซีนบีเทนได้ด้วย และเช่นเดียว กันความเค็มภายนอกที่เพิ่มขึ้นสามารถเพิ่มการสังเคราะห์ไกลซีนบีเทน โดยใช้สาร 2 ตัวนี้ได้ 3 การทำให้เอนไซม์บีเทนอัลดีฮายด์ดีไฮโดรจีเนสบริสุทธิ์และการศึกษาคุณสมบัติของ เอนไซม์ พบว่าสามารถทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต ตามด้วย โครมาโทกราฟฟีโดยดีอีเออีและไฮดรอกซีอะพาไทท์ตามลำดับ เอนไซม์ที่ได้ประกอบด้วย 4 หน่วย ย่อยที่มีขนาดหน่วยย่อยละ 30 กิโลดาลตัน เอนไซม์สามารถใช้ทั้ง เอนเอดี และเอนเอดีพี เป็นโค เอนไซม์ได้ สารประเภทที่ทำปฏิกิริยากับหมู่ซัลฟ์ไฮดริล สามารถเปลี่ยนแปลงแอคติวิตีของเอนไซม์ โปแทสเซียมและโซเดียมอิออนที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 0.1 โมลาร์ ลงมาช่วยกระตุ้นแอคติวิตี แต่ถ้า ความเข้มข้นสูงกว่า 0.1 โมลาร์ พบว่าขนาดของการกระตุ้นโดย K+ จะลดลง ในขณะที่จะเกิดการ ยับยั้งของแอคติวิตีโดย Na+ การเลี้ยงเซลล์ภายใต้ความเค็มภายนอกสูง ทำให้เซลล์มีแอคติวิตีของ เอนไซม์เพิ่มขึ้น The present investigation was undertaken to unveil the mechanism of osmoregulation in a cyanobacterium. The halophilic cyanobacterium that we used was Aphanothece halophytica which possesses advantageous characteristics of being able to grow in a wide range of salinity ranging from 0.25 M to 3 M NaCl. One aspect of the osmoregulation process in a variety of living organisms involves the synthesis and accumulation of a certain class of compound commonly known as a compatible or an osmoprotectant solute. In order to study the osmoregulation concerning the biosynthesis of a compatible solute, glycinebetaine in a systematic manner, we divided the project into 3 portions : 1 The conditions in which A. halophytica could accumulate glycinebetaine. The results indicated that the presence of high external salinity as well as an osmoticum namely sorbitol stimulated glycinebetaine accumulation. Chemical factor such as the presence of NaNO3 in the growth medium or physical factor such as light could facilitate the increase of glycinebetaine only in salt-stressed cells. 2 The biosynthetic pathway of glycinebetaine. The results of radiotracer experiments showed the likely pathway to be choline ? betaine aldehyde ? glycinebetaine. The operation of this pathway was supported by the finding that the enzyme activities responsible for these 2 steps; choline and betaine aldehyde dehydrogenases were detected in membrane and cytoplasmic fractions respectively. Increased external salinity could enhance the activities of these 2 enzymes. As in the case of glycinebetaine accumulation, increased external salinity also increased the rate of glycinebetaine synthesis of the cells. The evidence was also provided showing that glycinebetaine could be synthesized from either ethanolamine or glycine. These 2 synthetic routes were also stimulated by high external salinity. 3 The purification and characterization of the enzyme responsible for the last step of glycinebetaine synthesis namely betaine aldehyde dehydrogenase. The results showed that the purified enzyme, after ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose and hydroxyapatite chromatography was a tetramer of 30 kDa subunits. Both NAD+ and NADP+ could serve as coenzyme. Sulfhydryl reactive agents could modify enzyme activity. The presence of K+ and Na+ at or lower than 0.1 M enhanced enzyme activity. At higher than 0.1 M the magnitude of activation was decreased for K+ and inhibition was observed for Na+. Elevation of external salinity caused an increase in enzyme activity.