เชื้อกรดน้ำส้ม หรือ acetic acid bacteria เป็นเชื้อที่มีบทบาทในอุตสาหกรรมการผลิตกรด น้ำส้ม เนื่องจากสามารถออกซิไดซ์เอทานอลให้เป็นกรดน้ำส้ม โดยอาศัยเอนไซม์ 2 ชนิดที่เยื่อหุ้ม เซลล์ คือ alcohol dehydrogenase (ADH) และ aldehyde dehydrogenase (ALDH) นอกจากนี้ยัง มีบทบาทในการผลิต biopolymer เช่น เซลลูโลส จากการศึกษาสมบัติทางสรีร วิทยาและพันธุ ศาสตร์ของเชื้อกรดน้ำส้มที่แยกได้ในประเทศไทยจำนวน 129 ไอโซเลต เปรียบเทียบกับสายพันธุ์ มาตรฐานของญี่ปุ่น (IFO strains) จำนวน 15 สายพันธุ์ พบว่ามีเชื้อสายพันธุ์ไทยที่เจริญได้ที่ อุณหภูมิ 40?C จำนวน 51 ไอโซเลต และสายพันธุ์ญี่ปุ่นที่เจริญได้ที่อุณหภูมิเดียวกัน 8 สายพันธุ์ จากการคัดเลือกเชื้อโดยอาศัยสมบัติทางสรีรวิทยาและความสามารถในการผลิตกรดที่อุณหภูมิ ต่างๆ พบว่าเชื้อกรดน้ำส้มที่แยกได้จากสับปะรดและองุ่น คือ KU108 และ KU112 เป็นสายพันธุ์ที่ ผลิตกรดน้ำส้มได้ดีที่อุณหภูมิสูงและทนต่อความเข้มข้นเริ่มต้นของกรดน้ำส้ม (3%) และเอทานอล (8%) ได้ดีที่สุด ซึ่งจากการจำแนกเชื้อโดยอาศัยสมบัติทางชีวเคมี พบว่า KU108 และ KU112 เป็น สายพันธุ์ Acetobacter pasteurianus การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรม พบว่าเชื้อส่วนใหญ่ทั้งสายพันธุ์ของไทยและ ญี่ปุ่น มีพลาสมิดที่มีขนาดเล็กอยู่เป็นจำนวนมาก ระหว่าง 1->10 พลาสมิด ส่วนการศึกษาการ กระจายของ insertion sequence, IS1380 ซึ่งเป็นชิ้น DNA ที่แทรกเข้าไปตรงยีน alcohol dehydrogenase (adh gene) ในเชื้อกรดน้ำส้ม ปรากฏว่าตรวจพบ IS1380 ทั้งในเชื้อของไทยและ ญี่ปุ่นที่โครโมโซมและพลาสมิดขนาดใหญ่ แทบไม่พบสัญญานไฮบริไดซ์กับพลาสมิดขนาดเล็กที่มี อยู่หลายชนิด ซึ่งในจำนวนนี้มีสายพันธุ์ที่พบสัญญานไฮบริไดซ์ที่ชัดเจนจำนวน 17 ไอโซเลต (ประมาณ 13% ของเชื้อทั้งหมด) ส่วนสายพันธุ์ของญี่ปุ่นจำนวน 15 สายพันธุ์ ตรวจพบสัญญาน ไฮบริไดซ์ที่ชัดเจนใน 6 สายพันธุ์ (ประมาณ 40% ของเชื้อทั้งหมด) โดยการที่ตรวจพบสัญญานไฮบ ริไดซ์ที่ชัดเจนนี้แสดงว่าเชื้อดังกล่าวมี IS1380 หรือมี DNA ที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์คล้ายคลึงกับ IS1380 จำนวนหลายชุด (multicopies) โดยสายพันธุ์ที่พบว่ามี IS1380 หลายชุดนั้น แสดงว่ายีน adh ถูก inactivated และไม่สามารถเจริญในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเอทานอลความเข้มข้นสูง (8%) ที่ อุณหภูมิ 37?C และไม่สามารถเจริญในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกรดความเข้มข้นสูง (3%) ทั้งที่อุณหภูมิ 30 และ 37?C จากการศึกษาบทบาทของพลาสมิดในเชื้อกรดน้ำส้ม A. pasteurianus KU108 โดยการทำ plasmid curing ด้วยสาร sodium dodecyl sulfate (SDS) ความเข้มข้น 2.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และ acridine orange ความเข้มข้น 10.0 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ในอาหารเลี้ยงเชื้อ potato medium พบว่าสามารถแยก curant ที่แทบไม่มีพลาสมิดเลยได้ทั้งสิ้น 3 โคโลนี โดย curant ทั้ง 3 โคโลนีที่แยกได้มีสมบัติต่างๆคล้ายกับ parent strain เช่น การทำให้เกิด overoxidation การเจริญที่ อุณหภูมิ 40?C การเจริญในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี เอทานอลผสมอยู่ 8% ที่อุณหภูมิ 37?C การเจริญ ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกรดน้ำส้มผสมอยู่ 3% ที่อุณหภูมิ 30?C และลักษณะของเซลล์ภายใต้กล้อง จุลทรรศน์อิเลคตรอน การสร้างกรดในอาหารเหลวที่มีเอทานอลผสมอยู่ 4% และ 8% ที่อุณหภูมิ 30, 37 และ 40?C กิจกรรมของเอนไซม์ ADH และ ALDH ที่เตรียมจาก membrane fraction ของเชื้อที่เลี้ยง ใน static culture สูงกว่า shaking culture และการทำ heme staining ของเอนไซม์ ADH (subunit II หรือ cytochrome c complex) ก็ให้ผลสอดคล้องกันคือ ในปริมาณโปรตีนที่เท่ากัน แถบของ เอนไซม์ที่แยกจาก static culture มีความเข้มชัดกว่าจาก shaking culture และกิจกรรมของเอนไซม์ ทั้งสองในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเอทานอลผสมอยู่จะสูงกว่าในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มี เอทานอลหรือใน อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกรดน้ำส้มผสมอยู่ แต่เมื่อทำ heme staining ของเอนไซม์ในสภาวะดังกล่าว ปรากฏว่าความเข้มของแถบโปรตีนใกล้เคียงกันมาก แสดงว่าปริมาณของเอนไซม์ที่ membrane fraction ของเชื้อดังกล่าวใกล้เคียงกัน แต่ต่างกันที่กิจกรรมของเอนไซม์ซึ่งอธิบายได้ว่าในสภาวะที่ ไม่มีเอทานอลหรือในสภาวะที่มีกรดน้ำส้ม (low pH) จะพบเอนไซม์ ADH ในรูปของ inactive form ในอัตราส่วนที่สูงกว่าในสภาวะที่มีเอทานอล และจากการเปรียบเทียบกิจกรรมของเอนไซม์ทั้งสอง ในเชื้อกรดน้ำส้ม 10 ไอโซเลต พบว่าเอนไซม์ที่แยกจาก A. pasteurianus KU108 มีกิจกรรม ของเอนไซม์สูงสุด ซึ่งจากการศึกษาความสามารถในการทนอุณหภูมิสูงของเอนไซม์ทั้งสองจาก 10 ไอโซเลตข้างต้น โดยการ treat ที่อุณหภูมิที่อุณหภูมิต่างๆ คือ 30, 40, 50, 60 และ 70?C นาน 10 นาที พบว่าที่ 70?C ตรวจพบ residual activity ของเอนไซม์ ADH (3~4%) เฉพาะจากเอนไซม์ที่ แยกจาก A. pasteurianus KU108 เท่านั้น ส่วนที่สภาวะเดียวกันสำหรับเอนไซม์ ALDH พบ residual activity (3~4%) ใน A. pasteurianus KU108 ไอโซเลต KU111 KU112 และ saeki จากการวิเคราะห์ Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) ด้วยปฏิกิริยา ลูกโซ่โพลีเมอเรส (Polymerase Chain Reaction, PCR) เปรียบเทียบระหว่างสายพันธุ์ที่ทนและ สายพันธุ์ที่ไวต่ออุณหภูมิสูง โดยใช้ random primers ทั้งสิ้น 51 primers พบว่ามีเพียง primer เดียว คือ AD01 (5’-CAAAGGGCGG-3’) ที่สามารถสุ่มขยายได้ชิ้น DNA ที่เป็นลักษณะเฉพาะของกลุ่มที่ ทนอุณหภูมิสูงและไม่พบในกลุ่มที่ไวต่ออุณหภูมิ คือ ชิ้น DNA ขนาด 1.0 และ 1.3 กิโลเบส ซึ่งชิ้น DNA ทั้งสองนี้อาจใช้เป็น DNA marker ของการทนอุณหภูมิสูง ผู้วิจัยได้ subclone ชิ้น DNA ทั้ง สองเข้าสู่ pGEM?-T Easy vector เพื่อหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้น DNA ทั้งสองต่อไป Acetic acid bacteria plays a role in vinegar industry because of its ability to oxidize ethanol to acetic acid by two membrane bound enzymes; alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH). Moreover, it also involve in biopolymer production such as cellulose. Studies on physiological and genetic characteristics of 129 isolates from various fruits in Thailand and 15 IFO strains from Japan showed that 51 isolates and 8 strains from Thailand and Japan, respectively can grow at 40?C. Two isolates designated as KU108 and KU112 isolated from pineapple and grape were selected due to their abilities to produce acetic acid at high temperature and their high toleration to acetic acid (3%) and ethanol (8%). According to classification based on biochemical characteristics these two isolates are identified as Acetobacter pasteurianus. Analysis of genetic diversity showed that most of the new isolates and IFO strains harbor many small plasmids inside the cells ranging from 1 to >10 plasmids. Studies on distribution of insertion sequence, IS1380, inserted into alcohol dehydrogenase gene indicated that IS1380 was found on chromosome and large plasmid but not on small plasmid. Strong hybridization signals were detected in 17 Thai isolates (13% of total isolates) and 6 IFO strains (40% of total strains). This strong hybridization signals implicated that these bacteria harbor IS1380 or DNA containing multicopies of IS1380 homologs resulted in an inactivation of adh gene. So these isolates could not grow in a medium containing 8% ethanol at 37?C and in a medium containing 3% acetic acid both at 30 and 37?C. In order to study a role of plasmid in A. pasteurianus KU108, plasmid curing was done by sodium dodecyl sulfate (SDS) and acridine orange treatments in potato medium. Three curants possess no plasmid were obtained and all of them showed similar growth characteristics to the parent strain such as overoxidation, growth at 40?C, growth in a medium containing 8%ethanol at 37?C, growth in a medium containing 3% acetic acid at 30? C, electron microscopic appearance and acetic acid production at 30, 37 and 40?C. Enzyme activities of ADH and ALDH prepared from membrane fraction of a culture grown in static culture was higher than the one obtained from shaking culture. Moreover, heme staining of subunit II or cytochrome c subunit of ADH also showed that with the same amount of protein, a heme staining band of ADH from static culture was darker that the one from shaking culture. Enzyme activities of ADH and ALDH from culture grown in a medium containing ethanol was also higher than that from a culture grown in a medium with no ethanol or containing acetic acid. However, a heme staining band of ADH from membrane fraction of both cultures showed a same intensity. One reason for this phenomenon may be due to an inactivation of ADH protein from active to inactive form in the cultures grown in an ethanol free medium or in medium containing acetic acid (low pH). Comparison of enzyme activities from 10 thermotolerant isolates from Thailand indicated that the highest activities of both ADH and ALDH were obtained from A. pasteurianus KU108. Studies on stability of these enzymes at 30, 40, 50, 60 and 70?C for 10 minutes showed that at 70?C, 3-4% residual activity of ADH was obtained only in membrane fraction of A. pasteurianus KU108. At the same condition, 3-4% residual activity of ALDH were obtained from membrane fractions of KU108, KU111, KU112 and saeki. Random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) was used to investigate the genetic variations between thermotolerant and thermosensitive strains. Among 51 random primers only one primer known as AD01 (5’-CAAAGGGCGG-3’) could random amplify two specific DNA bands of 1.0 and 1.3 kb only with DNA isolated from thermotolerant strains. These two DNA bands may be a DNA marker of thermotolerance. Subcloning of these two DNA fragments into pGEM?-T Easy and nucleotide sequencing is in progress.