ในการวินิจฉัยโรค Leptospirosis ผู้วิจัยเลือกยีนส์จาก rfb locus ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ O-antigen ของ lipopolysaccharide ซึ่งคาดว่าน่าจะ conserved ครอบคลุม Leptospira species ได้เป็นส่วนมาก ในการศึกษาครั้งนี้ผู้วิจัยเลือก primers ที่ออกแบบจาก orf14 ทั้งนี้ primer คู่นี้ จะครอบคลุม Leptospira serovar ต่างๆ ยกเว้น L.interrogans serovar wolffi ผู้วิจัยยังนำระบบ nested PCR มาใช้เพื่อจะเพิ่มความไวในการตรวจ สำหรับปฏิกิริยา cross reactivity ที่เกิดกับ bacteria บาง species ได้แก้ปัญหาโดยเพิ่มอุณหภูมิ annealing ของ PCR รอบที่ 2 จาก 55 ?C เป็น 62 ?C ทั้งนี้จะป้องกัน non-specific product และไม่สามารถตรวจพบทั้งจาก gel electrophoresis และหลังจากกระบวนการ Southern hybridization โดยใช้ probe จาก nested primers คู่ใน จากการใช้ PCR test นี้กับ serum ผู้ป่วย Leptospirosis จะไม่สามารถเห็น PCR product อะไรเลยจาก agarose gel electrophoresis แต่จะเห็นได้หลังจากปฏิกิริยา Southern Hybridization เท่านั้น สำหรับจุดมุ่งหมายในการใช้ยีนส์ orf14 จำแนก Leptospira ออกเป็น serovar จำเพาะนั้นพบว่าไม่สามารถใช้ได้กับ serovar ส่วนมากที่เป็นสมาชิกของ L.interrogans อย่างไรก็ตามใน serovar hardjoprajitno และ serovar hardjobovis ซึ่ง rfb organization แตกต่างจาก L.interrogans จะมี orf14 sequence ที่แตกต่างกัน ซึ่งผู้วิจัยนำส่วนที่แตกต่างกันมาใช้ออกแบบ primer ที่มีความจำเพาะกับ serovar hardjo ได้แล้ว TO develop the PCR diagnosis for Leptospirosis, the oligo primers are selected from the rib locus that involved in biosynthesis of O-antigen, it is expected to have the primers that is conserved enough to cover most of the pathogenic Leptospira, but still possess the specificity. The oligo primers designed from orf14 sequence gave the promising results as they could amplify most of the Leptospira DNA panel except L.interrogans serovar wolffi. The nested PCR process was used to increase sensitivity of the test. The cross reactivity is still found with a few species of bacteria, however it could be prevented by increasing the annealing temperature of the second round nested-PCR from 55? C to 62? C. With this procedure none of the cross-reactivity product could be view by both gel electrophoresis and Southern hybridization, while the specific PCR – product from Leptospira remain. In another aspect to use the variation within orf14 sequence as the signature sequence to identify the Leptospiral serovar is the wrong hypothesis, since the recent orf14 sequence of L.interrogans serovars from database revealed that are quite conserved. However orf14 sequence of serovar hardjoprajitno that belong to L.interrogans haas a far distance-variation to other L.interrogans and the specific primers designed from this variation has already been obtained.