สามารถอาศัยอยู่ได้ภายในเซลล์ ( intracellular organism ) เช่นเชื้อ Burkholderia pseudomallei ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคเมลิออยโตซิส และ เป็นที่ยอมรับโดยทั่วไปว่าวัคซีนเป็นสามารถกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มทางด้านเซลล์ได้ดีโครงการวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์ที่จะทดลองผลิตวัคซีนเชื้อเป็นที่ทำให้อ่อนกำลังลงอย่างมีหลักการสำหรับโรคเมลิออยโตซิส และเพื่อที่จะประเมินศักยภาพในการที่จะนำมาใช้เป็นวัคซีน โดยใช้หนูเป็นโมเดลในการศึกษา การผลิตวัคซีนดังกล่าวจะอาศัยหลักการที่เรียก rational attenuation โดยการกลาย ( mutate ) จีน aroC ซึ่งจำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของเชื้อในร่างกายของโฮส การดำเนินการเริ่มจากการโคลนจีน aroC จากเชื้อ B.pseudomallei สายพันธ์ PHB111 ซึ่งแยกได้จากผู้ป่วย โดยอาศัยวิธีการ complement เชื่อ E.coli สายพันธ์ที่จีน aroC ถูกทำให้กลายไป การโคลนจีน aroC ทำได้โดยการเตรียม partial Sau3AI DNA library ขนาด 2- 4 kb จากนั้นนำไป transform เข้าเชื้อ E.coli aroC mutant และคัดเลือกโคลนที่ต้องการโดยการเลี้ยงใน M9 minmal medium ได้ complementing clone จำนวน 3 โคลน เลือก plasmid clone ที่มีขนาดเล็กสุดคือ pPHE 146 เพื่อทำการศึกษาต่อถึงตำแหน่งของ aroC gene โดยเทียบจาก genome sequence ของเชื้อ B.pseudomallei ที่มีรายงานไว้แล้ว ได้ทำการตัด Xhol fragment ขนาด 438 bp ซึ่งอยู่ภายใน aroC gene ออกไป โคลนที่ได้คือ pPHE149 จะสูญเสียความสามารถในการ complement E.coli aroC mutant จากนั้นได้ทำการโคลน Smal/HindIII fragment ซึ่งมี ?aroC จาก pPHE149 เข้าไปในเวคเตอร์ pEX19Tc ซึ่งเป็นเวคเตอร์ที่มี sacB gene ซึ่งใช้เป็น counterselectable marker โคลนที่ถูกต้องที่ได้คือ PHE150 ถูกนำไป conjugated กับเชื้อ B.pseudomallei PHB111 และเลือก transconjugants ที่ต้องการบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 5% sucrose เป็นส่วนผสม จากนั้นคัดเลือกเชื้อที่พึ่งสาร aromix ซึ่งจะเป็นเชื้อ B.pseudomalli ที่ต้องการ คัดเลือกเชื้อที่ต้องการได้ 2 โคลน ( PHB116 และ PHB117 ) และเลือกเชื้อ PHB117 เพื่อศึกษาต่อไป ผลการตรวจยืนยัน genotype โดยวิธี Southern blotting และวิธี PCR ได้ผลถูกต้องโดยไม่มีส่วนของเวคเตอร์แทรกอยู่ในโครโมโซมของเชื้อ PHB117 ผลการศึกษาโดยการ immunize หนู Balb/c พบว่าเชื้อกลายพันธ์ PHB116 มีความอ่อนแรงลงอย่างมากโดยมีค่า LD50 มากกว่า 1.96x10 6 cfu ทั้งทาง intraperitoneal และ nasal เมื่อเปรียบเทียบกับเชื้อตั้งต้น PHB111 ซึ่งมีค่า LD50 น้อยกว่า 20 cfu ผลการศึกษาศักยภาพในการใช้เป็นวัคซีน พบว่าการ immunize หนู Balb/c ทาง intraperitoneal ด้วยเชื้อกลายพันธ์ PHB117 จำนวนประมาณ 4 x10 7 cfu ครั้งเดียวหรือสองครั้ง ห่างกัน 2 อาทิตย์ จะไม่สามารถกระตุ้นให้เกิด protective immnity ในหนูเมื่อ challenge หนุดังกล่าวด้วยเชื้อตั้งต้น PHB111 ในจำนวนเชื้อประมาณ 10 เท่าของจำนวน PD50 ขณะที่กำลังอยู่ในระหว่างการศึกษาเพื่อดูว่า การ immonize หนู ทาง nasal จะคุ้มกันได้หรือไม่ รวมทั้งการศึกษาในหนูสายพันธ์ชนิดเพื่อดูว่าจะแตกต่างจากหนูที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้หรือไม่ Thhe aroC gene Burkholderia pseudomallei strain PHB111 , encoding 5 – enolpyruvylshimate-3-phosphate phospholyase ( chorismate synthase ) was cloned by complementation of the aroC mutation in E>coli after electroporation with a Sau3AI DNA constructed in pUC18 which had been restricted with BamHI. The Xhol fragment of 438 Kb internal of the cloned aroC gene was deleted and the resultant aroC-containing fragment was reintroduced by allelic exchange into the chromosome of the parental B.pseudomallei PHB111 via conjugation using pEX19Tc , a suicide vector containing a sacB gene as a counterselectable marker. Two independent ?aroC mutants of B.pseudomallei designated PHB116 and PHB117 were isolated. The marker – free aroC mutant of B. pseudomallei was highly attenuated in a Balb/c mouse model. However , mice immunized intraperitoncally with either a single dose or two doses of the B.pseudomallei aroC mutant were not protected against a lethal parental strain challenge. Protection study via nasal inoculation is underway to determine if this route can induce protection.