วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือ (1) การศึกษากระบวนการสร้างเซลล์สืบพันธุ์เพศผู้ และลักษณะการจัดระดับการเรียงตัวของใยโครมาตินในเซลล์สืบพันธุ์เพศผู้ของกบนา โดยการ สังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา และกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน และศึกษาใยโครมาตินที่ถูก คลี่ออกโดยสารสกัดจากไข่และน้ำกลั่น และศึกษาลักษณะ DNA ของเซลล์อสุจิโดยการย่อยด้วย micrococcal nuclease (2) การศึกษาเบสิกนิวเคลียโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของโครมาตินใน เซลล์สืบพันธุ์เพศผู้ของกบนา (3) การศึกษาการเปลี่ยนแปลงแทนที่ของเบสิกนิวเคลียโปรตีน ในเซลล์สืบพันธุ์เพศผู้ด้วยวิธี immunocytochemmistry โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน การศึกษาโครงสร้างของต่อมอัณฑะกบนาตัวโตเต็มวัย ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดา พบว่าต่อมอัณฑะประกอบด้วยท่ออัณฑะขนาดเล็กจำนวนมาก แต่ละท่อบรรจุเซลล์สืบพันธุ์ ระยะต่างๆ ซึ่งถูกโอบรอบโดยไซโตปลาสซึมของ folliculo-Sertoli cell ที่กลายเป็น spermatocyst เซลล์สืบพันธุ์ในแต่ละ cyst น่าจะเป็นเซลล์รุ่นเดียวกันที่มีกำเนิดมาจาก เซลล์ spermatogonium ขั้นตอนของกระบวนการสร้างเซลล์สืบพันธุ์เพศผู้สามารถแยกตาม ขนาด, รูปร่างของนิวเคลียส และตามลักษณะการจัดลำดับการขดตัวของใยโครมาตินได้ 14 ขั้น ดังนี้ เซลล์ spermatogonia มีสองระยะ (Sg1, Sg2) Sg1 มีนิวเคลียสขนาดใหญ่ประกอบด้วย euchromatin เป็นส่วนมาก ใยโครมาตินมีการจัดเรียงตัวเป็นสองระดับ คือ 10 และ 30 นาโนเมตร Sg2 มีการเกาะกลุ่มของก้อน heterochromatin ขนาดเล็กที่ด้านในของถุงหุ้ม นิวเคลียสและกระจายอยู่ทั่วทั้งนิวเคลียส primary spermatocyte แบ่งเป็น 6 ระยะคือ leptotene (LSc), zygotene (ZSc), pachytene (PSc), diplotene (DSc), diakinesis (DiSc) และ metaphase (MSc) นิวเคลียสของ LSc บรรจุใยโครมาตินขนาด 30 นาโนเมตร กระจายอยู่ทั่วไปและบางแห่งเริ่มขดพันรอบๆ แกนการขดตัว (condensation axis) กลายเป็นก้อน hetrochromatin ที่มีขนาดใหญ่ขึ้นและมีจำนวนมากขึ้นในระยะท้ายของ LSc ก้อนโครมาตินมีขนาดใหญ่มากขึ้นในระยะ ZSc และบางส่วนยึดติดกันโดย synaptonemal complex ก้อน heterchromatin ขดแน่นเป็นท่อนขนาดใหญ่ต่อเนื่องกันและกลายเป็นท่อนยาว ในระยะ PSc และ DSc ท่อน heterochromatin กลายเป็นโครโมโซมในขั้น DiSc ขยายใหญ่ขึ้น และท่อนโครโมโซมนี้จะถูกแยกออกจากกันและเคลื่อนไปอยู่ที่แนวกลางในขั้น MSc ในช่วง ต่างๆ ของ primary spermatocyte ใยโครมาตินขนาด 30 นาโนเมตร มีการขดตัวจัดเป็นก้อน heterochromatin ขนาดต่างๆ กัน ในขณะที่ใยโครมาตินขนาด 10 นาโนเมตร มีจำนวนลดลงและ ไม่ปรากฏในระยะ MSc Secondary spermatocyte (SSc) เป็นเซลล์ที่มีรูปร่างกลม นิวเคลียส มีก้อน heterchromatin ขนาดใหญ่ เกาะกลุ่มตามขอบของเยื่อหุ้มนิวเคลียสและที่บริเวณ ส่วนกลางของนิวเคลียส ใยโครมาตินขนาด 30 นาโนเมตร เริ่มคลี่ตัวออกและเริ่มปรากฏเส้นใย ขนาด 10 นาโนเมตรอีกครั้ง จากช่วง SSc ไป St1 พบว่าโครมาตินที่เคยพันกันแน่นจะมีการ จัดเรียงตัวใหม่ประกอบด้วยใยโครมาตินขนาด 10 และ 30 นาโนเมตรกระจายตัวอยู่อย่างหลวมๆ แต่สม่ำเสมอทั่วทั้งนิวเคลียส หลังจากนั้นในระยะ St2 ใยโครมาตินเริ่มมีการขดตัวเข้า หากันจนทำให้นิวเคลียสมีขนาดเล็กลงและเปลี่ยนรูปร่างจากทรงกลมเป็นทรงรี ในระยะ St3 นิวเคลียสมีรูปร่างยาวมากขึ้นและใยโครมาตินขนาด 30 นาโนเมตรขดพันกันหนาแน่นมากขึ้น แต่ยังกระจายอยู่เกือบสม่ำเสมอทั่วทั้งนิวเคลียสและไม่พบใยโครมาตินขนาด 10 นาโนเมตร ระยะ St3 นิวเคลียสมีรูปร่างยาวมากจนกลายเป็นรูปทรงกระบอก โครมาตินขดแน่นทั่วทั้ง นิวเคลียสแต่ยังสามารถสังเกตเห็นขอบเขตของเส้นใยขนาด 30 นาโนเมตร แต่ละเส้นอยู่ เซลล์อสุจิขั้นสมบูรณ์ มีส่วนหัวเป็นรูปทรงกระบอกเรียวยาว ภายในบรรจุโครมาตินที่มีการ ขดตัวแน่นทึบ มี acrosome คลุมอยู่ทางด้านหน้า ส่วน midpiece ประกอบด้วย centriole ที่ถูกล้อมรอบด้วย cylindrical fibrous sheath ที่มีลักษณะลาย และมีไมโตคอนเดรียกระจาย อยู่รอบๆ ส่วนหางที่เหลือประกอบด้วย axoneme ที่ล้อมรอบด้วยเยื่อหุ้มเซลล์ การศึกษาโดย ใช้ AUT PAGE พบว่าโครมาตินของเซลล์อสุจิยังมี nucleosomal core histone (H2A, H2B, H3, H4) และ variant of H1 (H1V) ซึ่งแทนที่ H1 เมื่อทดสอบปฏิกิริยาข้ามชนิดของ แอนติบอดีต่อ H3, H1, H1V และ H5 โดยวิธี immunoblotting พบว่าแอนติบอดีต่อ H1 มีปฏิกิริยาข้ามชนิดกับ H1V ในขณะที่แอนติบอดีต่อ H1V ไม่มีปฏิกิริยาข้ามชนิดกับ H1 ซึ่งหมายความว่าแอนติบอดีต่อ H1 สามารถจับกับ epitope ร่วมของ H1V และ H1 ในขณะที่ แอนติบอดีต่อ H1V จับกับ epitope ของ H1V ที่ไม่มีใน H1 นอกจากนั้นยังพบปฏิกิริยา ข้ามชนิดระหว่าง H1V และ H5 จึงหมายถึงการมี epitope ร่วมกันระหว่างโปรตีนสองชนิดนี้ ดังนั้น H1, H1V และ H5 ซึ่งอาจเป็นโปรตีนกลุ่มเดียวกันที่มีกำเนิดมาจากยีนอันเดียวกัน เมื่อย้อมเนื้อเยื่อของต่อมอัณฑะของกบนาด้วยแอนติบอดีต่อ H3 และ H1 พบว่า H3 และ H1 มีการกระจายอยู่ในนิวเคลียสของเซลล์สืบพันธุ์ทุกระยะ รวมทั้ง folliculo-Sertoli cell, Leydig cell, และเซลล์เม็ดเลือดแดง เมื่อย้อมด้วยแอนติบอดีต่อ H1V และ H5 พบว่า H1V และ H5 มีการกระจายอยู่เฉพาะในนิวเคลียสของเซลล์ในระยะ spermatids และ spermatozoa รวมทั้ง MSc และเม็ดเลือดแดง การกระจายของ H3 ในเซลล์สืบพันธุ์ระยะ spermatids (I-IV) และ spermatozoa แสดงว่า nucleosomal organization ยังคงรูปอยู่ในเซลล์ทุกระยะและ H1V อาจเป็นตัวกระตุ้นการขดตัวของใยโครมาติน การศึกษาการคลี่ของใยโครมาตินจากเซลล์ อสุจิด้วยสารสกัดจากไข่และน้ำกลั่น พบว่ามีใยโครมาตินขนาด 10 และ 30 นาโนเมตรปรากฏอยู่ การย่อยด้วยเอนไซม์ micrococcal nuclease ยังแสดงว่ามี nucleosome อยู่ในโครมาตินของ เซลล์สืบพันธุ์ทุกระยะรวมทั้งเซลล์อสุจิ ดังนั้น การขดตัวของใยโครมาตินในเซลล์สืบพันธุ์ เพศผู้ของกบนาซึ่งคล้ายกับการขดตัวของใยโครมาตินที่สร้างเป็นแท่งโครโมโซมขณะที่ เซลล์แบ่งตัวหรือการขดของใยโครมาตินที่กลายเป็นโครมาตินแน่นทึบ (heterochromatin) ในนิวเคลียสของเซลล์ร่างกายที่ปรับสภาพเต็มที่แล้ว เช่น เซลล์เม็ดเลือดแดงของกบและไก่ ซึ่งใช้ H5 ที่มีลักษณะคล้าย H1V มาก และเป็น H1V อีกชนิดหนึ่ง