???ยีนสำหรับสร้างเอ็นไซม์ไลเปสจากแบคทีเรียทนความร้อน สายพันธุ์?TL71?ถูกตัดต่อเชื่อมกับดีเอ็นเอพาหะ?pUC18? และถูกแสดงออกในเชื้อแบคทีเรียชนิด?Escherichia coli พบว่าโคลน?pUCTL71-1?สามารถสร้างเอ็นไซม์ไลเปสและหลั่ง ออกมานอกเซลล์สะสมในอาหารเลี้ยงเชื้อปริมาณสูง? วิทยานิพนธ์นี้กล่าวถึงการทำให้เอ็นไซม์นี้บริสุทธิ์โดย ผ่านอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเอ็นไซม์สะสมอยู่ลงในคอลัมน์ ฟินิลเซฟาโรสซีแอลสี่บี?และคอมลัมน์ดีอีเออีเซลลูโลส ตามลำดับ?ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า?เอ็นไซม์ไลเปสมีความ บริสุทธิ์เพิ่มขึ้น?276?เท่า?มีปริมาณ?activity?หลงเหลือ เป็น?68.8% และมี specific activity เท่ากับ?11,452 ยูนิต ต่อมิลลิกรัมโปรตีน?เมื่อทำการศึกษาขนาดของเอ็นไซม์นี้ โดยใช้คอลัมน์เซฟาเด็กซ์จี?100?พบว่ามีขนาดใหญ่กว่า? 100,000?ดาลตัน?แต่มีขนาด?38,000?ดาลตัน?เมื่อทำการวิ่ง วุ้นโพลีอะคริละไมด์ที่มี?SDS?เป็นส่วนประกอบ?และยังค้นพบ ต่อไปอีกว่า?แถบโปรตีนขนาด?38,000?ดาลตันที่ได้หลังการ วิ่งวุ้นโพลีอะคริละไมด์เท่านั้นจึงจะแสดงสมบัติของ เอ็นไซม์ไลเปสหลังจากกำจัด?SDS?ออกจากแผ่นวุ้นแล้ว จึงสรุปได้ว่าเอ็นไซม์ไลเปสเป็น?โมเลกุลเดี่ยวที่มีขนาด? 38,000?ดาลตัน?ซึ่งจะเกาะกลุ่มกันเป็นก้อนขนาดใหญ่กว่า 100,000?ดาลตัน?ในภาวะที่ไม่มี?SDS?อย่างไรก็ตามเอ็นไซม์นี้ ยังคงแสดงสมบัติของเอ็นไซม์ไลเปส?โดยการย่อยโมเลกุลของ สับสเตรทชนิดน้ำมันมะกอกหรือ?p-NPP?ทั้งเอ็นไซม์ที่ อยู่ในรูปโมเลกุลเดี่ยวหรือเกาะกลุ่มกันเป็นก้อน?นอกจาก นี้ยังพบว่า?เอ็นไซม์นี้มีค่า?pl เท่ากับ?7.75?และเสถียร ในช่วง?pH 8-12?ส่วนผลของอุณหภูมิพบว่า?เอ็นไซม์นี้ เกิดปฏิกริยาได้ดีที่อุณหภูมิ?45?องศาเซลเซียสและทนที่ อุณหภูมิ?55?องศาเซลเซียสเป็นเวลากว่า?5?วัน?โดยยังคงมี activity เหลืออยู่สูงถึง?65%?แต่ activity?ของเอ็นไซม์ จะลดลงอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่า?68?องศาเซลเซียส และเมื่อทำการศึกษาผลของสารเคมีต่อ?activity ของเอ็นไซม์ พบว่า?activity?ของเอ็นไซม์จะลดลง?17% เมื่อมี?PMSF อยู่เป็นปริมาณ?10 mM ต่อ?EDTA?ที่ความเข้มข้น?10?mM ไม่มีผลต่อ?activity?ของเอ็นไซม์เลย?แสดงว่ากรดอะมิโนเซรี อาจเกี่ยวข้องกับ?active site ของเอ็นไซม์?และไม่ว่า EGTA หรือ CaCl(,2)?ที่ความเข้มข้น 10 mM ก็ไม่มีผลต่อ activity?ของเอ็นไซม์?ผลการทดลองนี้ชี้ให้เห็นว่า? เอ็นไซม์ไลเปสนี้ไม่มีส่วนจับแคลเซียมประกอบในโมเลกุล นอกจากนี้ยังมีผลการทดลองที่แสดงว่า?activity?ของเอ็นไซม์ จะเพิ่มขึ้นประมาณ?2?เท่า?เมื่อมี?4%?Triton X-100?หรือ? 3M ยูเรียผสมอยู่?และ?activity ของเอ็นไซม์จะลดลงทันทีที่ มี?SDS เข้มข้นมากว่า?1% ??????สายยีนสังเคราะห์สำหรับเอ็นไซม์ไลเปส?(JPLip1)? ได้ถูกออกแบบและสังเคราะห์ขึ้นโดยมีพื้นฐานจากลำดับ กรดอะมิโนของเชื้อซูโดโมแนสฟราจี?สายพันธุ์?IFO 3458 แต่จากการตรวจสอบพบว่า?ลำดับเบสบนสายยีนสังเคราะห์ ดังกล่าวยังมีความผิดพลาดอยู่?วิทยานิพนธ์นี้จึงกล่าวถึง การซ่อมแซมสายยีนสังเคราะห์?JPLip 1?จนกระทั่งได้สายยีน สังเคราะห์?JPLip 2 ที่มีลำดับเบสเหมือนกับ?JPLip 1? เว้นแต่มีการกลายของเบสที่ตำแหน่ง?156?จาก?A เป็น?G และตำแหน่ง?172?จาก?T เป็น?A?ซึ่งการกลายดังกล่าวไม่มี ผลกระทบต่อลำดับกรดอะมิโนของเอนไซม์ตามที่ออกแบบไว้แต่แรก ??????สายยีนสังเคราะห์?JPLip 2?สามารถผลิตโปรตีนในเชื้อ แบคทีเรียเจ้าบ้านชนิด?Escherichia coli สายพันธ์?jM 109 ภายใต้การควบคุมของยีน?lac Z ที่เป็นส่วนหนึ่งของดีเอ็นเอ พาหะ?pBluescript SK+?คิดเป็นปริมาณ?12%?ของปริมาณโปรตีน ทั้งหมดในเซลล์โปรตีนที่ผลิตได้นี้จะสะสมอยู่ใน โซโตพลาสซึมของเซลล์เจ้าบ้านในรูปของอินคลูชั่นบอดี้?ซึ่ง มีขนาดโมเลกุง?19,000?ดาลตัน?เท่ากับขนาดของโปรตีนที่ออก แบบไว้?(14,643?ดาลตัน)?รวมกับปลายอะมิโนของเอนไซม์ เบตา-กาแลคโตไซเดส?และที่สำคัญคือ?เอนไซม์นี้อยู่ในรูปที่ ไม่มี?activity จึงต้องใช้กัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์,?ยูเรีย และ?CtAB?เพื่อละลายเอ็นไซม์ออกมาจากอินคลูชั่นบอดี้?และ ทำให้เอนไซม์คืนสู่สภาพที่มี activity?ผลการวิจัยชี้ให้ เห็นว่าเอ็นไซม์ที่ผ่านกระบวนการดังกล่าวโดยใช้?CTAB?จะมี activity?สูงกว่าที่ใช้ยูเรียหรือกัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์? และเอ็นไซม์ที่ผ่านกระบวนการคืนสภาพโดยใช้?CTAB?จะมี activity สูงกว่าเอนไซม์ตัวเดียวกันที่แสดงออกโดยสายยีน ธรรมชาติกว่า?3.7?เท่า