| ชื่อเรื่อง | : | การตัดต่อขยายยีนและสังเคราะห์โปรตีนส่วนเปลือกหุ้มของ เชื้อไวรัสไข้เลือดออกเดงกี่ ในเชื้อแบคทีเรีย เอสเชอริเชีย โคไล |
| นักวิจัย | : | รุ่งเรือง จารุมโนกุล |
| คำค้น | : | - |
| หน่วยงาน | : | ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย |
| ผู้ร่วมงาน | : | - |
| ปีพิมพ์ | : | 2539 |
| อ้างอิง | : | http://www.thaithesis.org/detail.php?id=41762 |
| ที่มา | : | - |
| ความเชี่ยวชาญ | : | - |
| ความสัมพันธ์ | : | - |
| ขอบเขตของเนื้อหา | : | - |
| บทคัดย่อ/คำอธิบาย | : | โรคที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสเดงกี่เป็นปัญหาสาธารณสุข ของประเทศไทยและประเทศอื่นๆ ในแถบเอเซียอาคเณย์ การตรวจ ทางห้องปฏิบัติการเพื่อวินิจฉัยโรคทำได้โดยการแยกเชื้อไวรัส การตรวจจีโนม และการตรวจทางภูมิคุ้มกันวิทยาต่างๆ การ ยับยั้งการจับกลุ่มของเม็ดเลือดแดง การตรวจหาแอนติบอดี ไอจี-เอ็มและไอจี-จีด้วยวิธีอีไลซ่า การตรวจหาแอนติบอดี ด้วยวิธีหยดแอนติเจนบนแผ่นไนโตรเซลลูโลส (ดีอีไอเอ) เป็นอีกวิธีหนึ่งที่เพิ่งมีการพัฒนาเพื่อการวินิจฉัยเบื้องต้นและ ใช้ตรวจเพื่อการเฝ้าระวังทางระบาดวิทยาของไข้เลือดออก แอนติเจนที่จะใช้ในการตรวจทางภูมิคุ้มกันวิทยาเหล่านี้เป็น ไวรัสที่เตรียมแบบดั้งเดิม โดยการฉีดเชื้อเข้าทางสมองหนู แรกเกิด หรือการเลี้ยงเชื้อในเซลล์เพาะเลี้ยง ซึ่งวิธีแรก ใช้แรงงานและเวลามาก ส่วนวิธีหลังนั้นยุ่งยากและราคาแพง จึงมีความต้องการที่จะหาวิธีอื่นที่ง่ายและประหยัดกว่า เพื่อที่จะศึกษาความเป็นไปได้ในการนำวิธีทางพันธุ- วิศวกรรมมาผลิตแอนติเจนของไวรัสเด็งกี่ จึงได้ทำการตัดต่อ ขยายยีนของโปรตีนส่วนเปลือกหุ้มและนำมาใส่ให้มีการสังเคราะห์ โปรตีนในแบคทีเรีย อี โคไล ยีนของโปรตีนส่วนเปลือกหุ้ม ความยาว 1,233 นิวคลีโอไทด์ (จากทั้งหมด 1,485 นิวคลีโอไทด์) ซึ่งใช้เป็นรหัสสำหรับกรดอะมิโนจำนวน 411 ตัว (โดยตัดกรด อะมิโนจำนวน 84 ตัว ซึ่งเป็นชนิดที่ไม่เข้ากับน้ำทางปลาย คาร์บ๊อกซี่ของโปรตีนออก) แยกมาจากจีโนมของไวรัสเด็งกี่ ชนิดที่ 2 (สายพันธุ์ เอ็นจีซี) ด้วยวิธีสังเคราะห์ดีเอ็นเอจาก อาร์เอ็นเอ และเพิ่มจำนวนอณูดีเอ็นเอด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่ของ เอนไซม์โพลีเมอเรส (อาร์ที-พีซีอาร์) โดยใช้ไพรเมอร์ที่ ออกแบบให้มีตำแหน่งตัดของเอนไซม์เรสติคชั่น เอ็นโดนิวคลีเอส ที่แตกต่างกันข้างละชนิด เพื่อบังคับการสอดยีนเข้าในพลาสมิด (pGEX-3X) ในทิศทางที่ต้องการ ยีนของโปรตีนส่วนเปลือกหุ้ม จะเชื่อมต่อกับยีนของเอ็นไซม์กลูตาไธโอน-เอส-ทรานเฟอเรส (จีเอสพี) ของพยาธิใบไม้ในเลือด ซีสโตโซม่า จาปองนิกุม (Schistosoma japonicum) ซึ่งอยู่ในพลาสมิดที่ใช้เป็น ดีเอ็นเอพาหะ เพื่อว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีนที่ได้จะนำมาแยก ให้บริสุทธิ์ โดยการจับอย่างจำเพาะของจีเอสทีกับเม็ด กลูตาไธโอน (จีเอสเฮช) เซ็บฟาโรส จากกลุ่มเซลล์แบคทีเรีย ของ อี โคไล ที่ได้จำนวน 8 สายมี 4 สายของกลุ่มเซลล์ที่ สามารถเหนี่ยวนำให้มีการสังเคราะห์รีคอมบิแนนท์โปรตีน ที่ มีน้ำหนักโมเลกุล 68 กิโลดัลตัน เมื่อทำการตรวจสอบด้วย เจลโพลิอะครีลามายด์ซึ่งมีสารละลายไขมันเอสดีเอส (SDS-PAGE) รีคอมบิแนนท์โปรตีนนี้ทำปฏิกิริยาได้กับ แอนติบอดีต่อไวรัสเด็งกี่ชนิดโพลีโคลนอล (จากน้ำเหลือง ผู้ป่วยในระยะฟื้นไข้ หรือ พีซีเอส) และชนิดโมโนโคลนอล ในการวิเคราะห์ด้วยวิธีซับย้ายโปรตีนแบบเวสเทิร์น รวมทั้ง ตรวจพบโปรตีนที่มีขนาดเล็ก ซึ่งอาจจะเกิดจากการสลายตัว ของรีคอมบิแนนท์โปรตีน รีคอมบิแนนท์โปรตีนมีการเกาะกลุ่มรวมตัวกัน ซึ่งอาจ จะอยู่ในลักษณะเม็ดอินคลูชั่นในเซลล์แบคทีเรีย อี โคไล และ ไม่ละลายน้ำในภาวะปกติ ละลายได้ในบัฟเฟอร์ที่มีสารละลาย ไขมันเอสดีเอสความเข้มข้นร้อยละ 1 หรือซาร์โคซีลความ เข้มข้นร้อยละ 1.5 หรือยูเรียความเข้มข้น 8 โมลาร์ แต่ ไม่สามารถจะนำมาแยกให้บริสุทธิ์โดยจับกับจีเอสเฮช-เซ็บฟาโรส ดังนั้นจึงแยกรีคอมบิแนนท์โปรตีนจากโปรตีนอื่นๆ ของเซลล์ โดยการปั่นและล้างด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์ซาไลน์ (พีบีเอส) ที่มีไตรตัน เอ็กซ์-100 ความเข้มข้นร้อยละ 1 และละลาย ในบัฟเฟอร์ที่มียูเรีย 8 โมลาร์ก่อนจะนำมาแยกให้บริสุทธิ์ขึ้น ด้วยวิธี ดีอีเอดี-เซ็บฟาเซล คอลัมน์โครมาโตกราฟฟี่เพื่อจับ กับโปรตีนโดยอาศัยประจุไฟฟ้า (DEAE-Sephacyl ion-exchange column chromatography) รีคอมบิแนนท์โปรตีนที่แยกให้บริสุทธิ์ ขึ้นนี้ยังคงทำปฏิกิริยาได้กับพีซีเอสและโมโนโคลนอลแอนติบอดี เมื่อนำรีคอมบิแนนท์โปรตีนนี้มาทดสอบกับน้ำเหลืองของผู้ป่วย ซึ่งติดเชื้อไข้เลือดออกและผู้ป่วยซึ่งติดเชื้ออื่นๆ พบว่าสามารถ ทำปฏิกิริยาได้และมีความจำเพาะ อาจจะใช้เป็นแอนติเจนใน การพัฒนาวิธีตรวจวินิจฉัยทางภูมิคุ้มกันวิทยาได้ |
| บรรณานุกรม | : |
รุ่งเรือง จารุมโนกุล . (2539). การตัดต่อขยายยีนและสังเคราะห์โปรตีนส่วนเปลือกหุ้มของ เชื้อไวรัสไข้เลือดออกเดงกี่ ในเชื้อแบคทีเรีย เอสเชอริเชีย โคไล.
กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย. รุ่งเรือง จารุมโนกุล . 2539. "การตัดต่อขยายยีนและสังเคราะห์โปรตีนส่วนเปลือกหุ้มของ เชื้อไวรัสไข้เลือดออกเดงกี่ ในเชื้อแบคทีเรีย เอสเชอริเชีย โคไล".
กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย. รุ่งเรือง จารุมโนกุล . "การตัดต่อขยายยีนและสังเคราะห์โปรตีนส่วนเปลือกหุ้มของ เชื้อไวรัสไข้เลือดออกเดงกี่ ในเชื้อแบคทีเรีย เอสเชอริเชีย โคไล."
กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย, 2539. Print. รุ่งเรือง จารุมโนกุล . การตัดต่อขยายยีนและสังเคราะห์โปรตีนส่วนเปลือกหุ้มของ เชื้อไวรัสไข้เลือดออกเดงกี่ ในเชื้อแบคทีเรีย เอสเชอริเชีย โคไล. กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย; 2539.
|
