โรคไข้เลือดออกเป็นโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัสเด็งกี่โดยมียุงลาย (Aedes aegypti และ Aedes albopictus) เป็นพาหะนำโรคไวรัสเด็งกี่มีสารพันธุกรรมเป็นอาร์เอนเอ สายเดี่ยว ล้อมรอบด้วยนิวคลีโอแคปสิต ประกอบด้วยยีนที่สังเคราะห์โปรตีนโครงสร้างและ โปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง โดยมีลำดับการเรียบตัวของยีนดังนี้ 5 C-preM-E-NS1-NS2a-NS3-NS4a-NS4b-NS5 3 งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อผลิตรีคอมบิแนนต์โปรตีนส่วนเปลือกหุ้มของเชื้อไวรัสเด็งกี่ ระบบของเซลล์ Escherichia coli (E.coli) โดยการสกัดอาร์เอนเอของไวรัสเด็งกี่ ซีโรทัยป์ 3 สายพันธุ์ H87 จากน้ำเลี้ยงเซลล์เพาะเลี้ยง C6/36 ที่มีการติดเชื้อไวรัสและ เพิ่มจำนวนยีนส่วนเปลือกหุ้มจากอาร์เอ็นเอโดยวิธีรีเวอร์สทรานสคริบชั่นและโพลีเมอเรส เชนรีแอคชั่น (RT-PCR) พบว่าได้ชิ้นอาร์ที-พีซีอาร์โปรดักส์ ขนาด 1,264 นิวคลีโอไทด์ ที่ประกอบด้วยส่วนของยีนส่วนเปลือกหุ้ม (den3E) และลำดับเบสของเรสติกชั่นเอนไซม์ ที่ปลาย 5 และ 3 เพื่อใช้ในการทำโคลนนิ่ง ยีน den3E ประกอบด้วย 1,227 นิวคลีโอไทด์ จากยีนส่วนเปลือกหุ้มทั้งหมด 1,479 นิวคลีโอไทด์ ซึ่งครอบคลุมกรดอะมิโน 409 ตัว แต่ไม่ รวมกรดอะมิโนที่ไม่ละลายน้ำ 84 ตัว จากปลายคาร์บอกซี นำพีซีอาร์โปรดักส์มาตัดด้วยเรสติกชั่น เอนไซม์คือ BamHI และ EcoRI และทำการโคลนนิ่งเข้าในเวคเตอร์ pTrcHisA ซึ่งเป็น เวคเตอร์สำหรับการแสดงออกของโปรตีนส่วนเปลือกหุ้มในระบบ Escherichia coli โคลนที่มีรีคอมบิแนนต์พลาสมิด (pTrcHisA/den3E) สามารถผลิตรีคอมบิแนนต์โปรตีนส่วน เปลือกหุ้มที่มีกรดอะมิโนฮีสติดีน 6 ตัวเป็นเปปไทด์พาหะ (6H-D3E) เมื่อมีการเหนี่ยวนำด้วย สารละลาย IPTG 1 มิลลิโมลาร์ โดยโปรตีน 6H-D3E ที่ได้มีขนาดประมาณ 55 กิโลดาลตัน อยู่ในรูปที่ไม่ละลายน้ำ สามารถละลายได้ในบัฟเฟอร์ที่มีส่วนประกอบของสารดีเนเจอร์แรนท์ ที่รุนแรงคือ สารละลายกัวนีดีน 6 โมลาร์และถูกแยกให้บริสุทธิ์โดยใช้ Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) ในสภาวะที่โปรตีนถูกทำลายโครงสร้าง ธรรมชาติ (denaturing) โปรตีน 6H-D3E ที่บริสุทธิ์ถูกชะออกจากเรซินโดยสารละลาย บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยสารละลายยูเรีย 8 โมลาร์ ในสภาวะที่เป็นกรด (พีเอช 4.5) และ สามารถกลับคืนสภาพโครงสร้างธรรมชาติของโปรตีน (Refolding) โดยการกำจัดยูเรีย ออกจากสารละลายโปรตีน 6H-D3E ด้วยวิธีไดอะไลซ์ในสารละลายบัฟเฟอร์ที่ลดความเข้มข้น ของยูเรียลงเป็นลำดับจนไม่มียูเรียเหลืออยู่ และเติมสารละลาย Triton X-100 ความเข้มข้น 0.1 เปอร์เซ็นต์เข้าไปแทนที่ในบัฟเฟอร์สุดท้าย จากการทดสอบคุณสมบัติทางชีวภาพของรีคอมบิแนนต์ โปรตีน 6H-D3E ที่ได้พบว่าสามารถทำปฏิกิริยาได้ดีกับซีรั่มรวมของผู้ป่วยไข้เลือดออก (PCS) และโมโนโคลนอลแอนติบอดี ซึ่งจำเพาะต่อโปรตีนส่วนเปลือกหุ้มของไวรัสเด็งกี่ซีโรทัยป์ 3 (10C10) จากการทดสอบโดยวิธี western blot พบโปรตีนปนเปื้อนจากเซลล์ Escherichia coli ขนาดประมาณ 90 กิโลดาลตัน ที่ถูกแยกมาพร้อมกับโปรตีน 6H-D3E บริสุทธิ์ดังต่อไปนี้ 1) หลังขั้นตอนการทำให้เซลล์แตกโดยใช้คลื่นอุลตร้าโซนิคแล้วล้างตะกอน 6H-D3E ด้วยสาร ละลายที่ประกอบด้วย Triton X-100 ความเข้มข้น 0.5 เปอร์เซ็นต์ และ 2) เพิ่มปริมาณ สารละลายยูเรีย 8 โมลาร์ พีเอช 8.0 เพื่อเลี้ยงโปรตีนที่ไม่จับกับเรซินก่อนขั้นตอนการชะ โปรตีนออกจากคอลัมน์ โปรตีนบริสุทธิ์ 6H-D3E ที่ได้หลังขั้นตอนการคืนสภาพโครงสร้าง ธรรมชาติสามารถทำปฏิกิริยาได้ดีต่อซีรัมรวมของผู้ป่วยไข้เลือดออก และไม่ทำปฏิกิริยากับซีรัม รวมของคนปกติ โดยวิธี dot enzyme immunoassay (DEIA) ดังนั้นรีคอมบิแนนต์โปรตีน 6H-D3E ที่ผลิตได้นี้น่าจะมีศักยภาพที่สามารถนำไปใช้เป็นแอนติเจนในชุดตรวจวินิจฉัยโรค ไข้เลือดออกเพื่อพัฒนาการตรวจสอบทางภูมิคุ้มกันวิทยาต่อไป