| ชื่อเรื่อง | : | การวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และการโคลนยีนฟินิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจากแบคทีเรียทนร้อน ~iBacillus badius~i BC1 |
| นักวิจัย | : | จิตติมา เจริญพานิช |
| คำค้น | : | PHENYLALANINE DEHYDROGENASE , NUCLEOTIDE SEQUENCE , PCR CLONING , THERMOTOLERANT BACTERIA , OVEREXPRESSION |
| หน่วยงาน | : | ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย |
| ผู้ร่วมงาน | : | - |
| ปีพิมพ์ | : | 2544 |
| อ้างอิง | : | http://www.thaithesis.org/detail.php?id=1082544001658 |
| ที่มา | : | - |
| ความเชี่ยวชาญ | : | - |
| ความสัมพันธ์ | : | - |
| ขอบเขตของเนื้อหา | : | - |
| บทคัดย่อ/คำอธิบาย | : | ฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส (EC 1.4.1.20) เร่งปฏิกิริยาการดึงหมู่อะมิโนจากแอล-ฟีนิลอะลานีนให้ผลิตภัณฑ์คือแอมโมเนีย ฟีนิลไพรูเวท และ NADH ซึ่งเป็นปฏิกิริยาที่ผันกลับได้และต้องการ NAD('+) เป็นโคเอนไซม์ จากปฏิกิริยาดังกล่าวจึงได้มีการนำเอนไซม์นี้มาใช้ในการสังเคราะห์แอล-ฟีนิลอะลานีนซึ่งเป็นสารต้นตอในการผลิตสารให้ความหวานแอสพาเทม รวมทั้งนำมาประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัยโรคนีโอนาทาลไฮเปอร์ฟีนิลอะลานีเมียและฟีนิลคีโตนิวเรียอีกด้วย จากการจำแนกแบคทีเรียทนร้อนสายพันธุ์ BC1 ที่มีแอคติวิตีของฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสสูง โดยใช้สมบัติทางสัณฐานวิทยาและชีวเคมี รวมทั้งลำดับเบสบริเวณอนุรักษ์ของ 16S rRNA พบว่าเป็น ~iBacillus badius~i นอกจากนี้ยังพบว่าลำดับกรดอะมิโนบริเวณปลายอะมิโนคือ TSIIKDFTLFEKMSEHEQV VFANDPATGLR และส่วนภายในของสายโปรตีนคือ GMTYKXAASDVDFGGGKAVIIGDPQKDKSPELFRAFGQFVDSLGGRFYTGTDMGTNMEDFIHAMK, ATNK, DDLGGVTYAIQGLGKVGYKVAEGLLEEGAHLFVT,AIAGSANNQLLTEDHGRHLADK, ERVLAK, และ WDIRN จากผลการทดลองนี้ใช้เป็นข้อมูลพื้นฐานในการออกแบบไพรเมอร์เพื่อเพิ่มชิ้นยีนส่วนในของฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสยีนโดยเทคนิคพีซีอาร์ซึ่งใช้โครโมโซมอลดีเอ็นเอที่ผ่านการย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะเป็นดีเอ็นเอต้นแบบจากนั้นนำผลิตภัณฑ์จากพีซีอาร์ที่ได้ไปวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และนำมาเป็นข้อมูลในการออกแบบไพรเมอร์ในการเพิ่มชิ้นยีนในส่วนปลาย 5' และ 3' ที่ยังไม่ทราบลำดับนิวคลีโอไทด์โดยเทคนิคพีซีอาร์ที่อาศัยการเชื่อมต่อชิ้นคาสเซท จากการวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์พบว่าชิ้นยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสแปลรหัสพันธุกรรมได้สายพอลิเปปไทด์ที่มี 380 กรดอะมิโนนำฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสยีนที่ได้มาโคลนเข้าสู่ ~iE. coli~i JM109 เมื่อวิเคราะห์สารละลายเอนไซม์ที่ได้จากโคลน พบว่าเอนไซม์มีค่าแอคติวิตีรวมอยู่ในช่วง 0-360ยูนิตต่ออาหารเลี้ยงเชื้อ 100 มิลลิลิตร แอคติวิตีสูงที่สุดของโคลนที่พบสูงกว่าแอคติวิตีจาก ~iBacillus badius~i BC1 ประมาณ 60 เท่า เวลาที่เหมาะสมในการเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสสูงคือ 120 นาทีก่อนเก็บเซลล์ จากการทดสอบความเสถียรของยีนฟินิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสในเซลล์เจ้าบ้าน ~iE. coli~iJM 109 โดยใช้วิธีเลี้ยงโคลนที่มีเอนไซม์แอคติวิตีสูงต่อเนื่องวันต่อวันเป็นเวลา 15 วันพบว่ารูปแบบและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสใน 5 โคลน จาก 6 โคลนยังคงมีความเสถียรโดยปราศจากกระบวนการกำจัดออกของเซลล์เจ้าบ้านในช่วง 15 รุ่นขณะที่หนึ่งโคลนถูกกำจัดชิ้นยีนออกไป และจากการส่งถ่ายรีคอมบิแนนท์พลาสมิดสู่เซลล์เจ้าบ้าน ~iE. coli~i JM109 อีกครั้งโดยการใช้กระแสไฟฟ้า พบว่ารูปแบบของพลาสมิดยังคงเหมือนเดิม และให้แอคติวิตีของฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจีเนสในปริมาณที่คงที่ |
| บรรณานุกรม | : |
จิตติมา เจริญพานิช . (2544). การวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และการโคลนยีนฟินิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจากแบคทีเรียทนร้อน ~iBacillus badius~i BC1.
กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย. จิตติมา เจริญพานิช . 2544. "การวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และการโคลนยีนฟินิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจากแบคทีเรียทนร้อน ~iBacillus badius~i BC1".
กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย. จิตติมา เจริญพานิช . "การวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และการโคลนยีนฟินิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจากแบคทีเรียทนร้อน ~iBacillus badius~i BC1."
กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย, 2544. Print. จิตติมา เจริญพานิช . การวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และการโคลนยีนฟินิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจากแบคทีเรียทนร้อน ~iBacillus badius~i BC1. กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย; 2544.
|
