โปรตีนพิษ Adenylate cyclase-hemolysin (CyaA) ที่หลัง่ จากเชื้อแบคทีเรีย Bordetella pertussis เป็นหนึ่งในสมาชิกของตระกูลโปรตีนพิษ RTX (Repeat-in-ToXin) ที่สามารถทำให้เกิดรู รัว่ บนผิวเซลล์เป้าหมายได้ จากการศึกษาก่อนหน้านี้ ได้ทำการสร้างโปรตีนพิษ CyaA เฉพาะส่วน poreforming domain (CyaA-PF) ที่มีขนาด 126 kDa ให้มีการแสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli แล้วทำให้ เม็ดเลือดแดงแตกได้ ผลการวิเคราะห์กรดอะมิโนในตำแหน่งของ hydrophobic region ในช่วงกรดอะมิโน ตำแหน่งที่ 500-700 โดย hydropathy plot พบความเป็น transmembrane -helical bundle ที่ประกอบด้วย เกลียวอัลฟ่าจำนวนห้าเกลียว ซึ่งน่าจะเป็นส่วนที่แทงเข้าไปในเมมเบรนและทำให้เกิดรูรัว่ ส่งผลให้เซลล์แตกได้ ในการศึกษานี้จะทำการโคลนเฉพาะชิ้นส่วน hydrophobic region (M482 - A751) จากพลาสมิดต้นแบบ pCyaAPF (M482 - R1706) เพื่อศึกษากลไกการสร้างรูรัว่ บนผิวเซลล์ เมื่อนำไปแสดงออกใน E. coli พบว่า โปรตีน CyaA-HPR ที่ได้มีขนาดเล็กประมาณ 30 kDa ซึ่งมีการแสดงออกที่ไม่เด่นชัด มีปริมาณน้อยและไม่สามารถทำ ให้เซลล์เม็ดเลือดแดงแตกได้ แต่เมื่อทำการโคลนในรูปแบบใหม่ โดยตัดเฉพาะส่วน repeat region repetitive block II-V ในช่วงกรดอะมิโนตำแหน่ง 1091-1652 ออก พบว่า โปรตีน CyaA-PF1091-1652 ที่ทำการเติม His tag เพื่อประโยชน์ในการทำให้บริสุทธิน์ ี้ มีขนาดประมาณ 70 kDa มีการแสดงออกสูง อยู่ในรูปที่ละลายน้ำ และสามารถทำให้เม็ดเลือดแดงแตกได้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่า โปรตีนชิ้นส่วนนี้มีโครงสร้างที่จำเป็นต่อ ความสามารถในการทำให้เกิดรูรัว่ บนผิวเซลล์ขัน้ พื้นฐานได้ เมื่อวิเคราะห์ร่วมกับโครงสร้างสามมิติที่แสดงให้ เห็นถึงความเป็นเกลียวอัลฟ่า 5 เกลียวในช่วง hydrophobic region และการเรียงตัวแบบ Beta-roll ในช่วงของ RTX region จากทาง C-terminal folding ร่วมกับผลการทดลองที่ได้ แสดงให้เห็นว่า ส่วนของ hydrophobic region, ตำแหน่งของการเติมหมู่ไขมันที่กรดอะมิโนไลซีน 983, RTX repetitive block I (M482 – N1090) กับชิ้น ทางด้าน C-terminal (V1653-R1706) มีความเกี่ยวข้องในการจัดเรียงตัวโครงสร้างของโปรตีนและเหนี่ยวนำในการ สร้างรูรัว่ บนผิวเซลล์ Bordetella pertussis adenylate cyclase-hemolysin toxin (CyaA) represents a unique RTX (Repeat-in-ToXin) pore-forming toxin that can permeabilize the target membrane by forming lytic pores. Previously, the 126-kDa CyaA pore-forming (CyaA-PF) domain expressed in Escherichia coli was shown to retain its hemolytic activity. The preliminary results from hydropathy plot based on hydrophobicity analysis of an amino acid, together with mutagenesis studies, suggested that the transmembrane domain of CyaA is the hydrophobic region between residues 500 to 700 and contains a five putative -helical bundle. It is planned to investigate whether the hydrophobic region of the CyaA toxin (CyaA-HPR) can equip for membrane insertion and pore formation. In this study, the gene segment encoding the region (M482 - A751) was subcloned from pCyaA-PF (M482 - R1706) plasmid and expressed as a 30-kDa CyaA-HPR protein in E. coli under T7 promoter. The CyaA-HPR proteins were unable to express themselves well and to exert the hemolytic activity. However, CyaA-PF fragment with flanking the four CyaA-RTX repetitive block II -V named CyaA-PF1091-1652 was subcloned for solving the problem. The His-tag fused truncated CyaA-PF was highly expressed as the 70-kDa soluble protein and shown to be a minimal active fragment for pore formation. Taking together with the 3D homology model-based five putative helical segments of CyaA-HPR and repetitive parallel beta-roll of CyaA-RTX structures, suggested that hydrophobic region, segments of a post-translational acylation site-K983 to CyaA-RTX repetitive block I (M482 – N1090) with the C-terminal region (V1653-R1706) are important for the structural integrity of CyaA toxin for conformational changes and domain fitting in the pore state.