งานวิจัยและพัฒนาดีเอ็นเอวัคซีนเพื่อป้องกันโรคไข้เลือดทั้ง 4 สายพันธุ์ จากหลายแห่ง รวมทั้งวัคซีนต้นแบบที่เราได้พัฒนาขึ้นมานั้น ต่างประสบกับปัญ หาในการกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันต่อเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 ได้ต่าที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับซีโรไทป์อื่น งานวิจัยนี้จึงพัฒนาขึ้นเพื่อเพิ่มระดับภูมิคุ้มกันต่อเชื้อไวรัสซีโรไทป์ 4 ซึ่งประกอบไปด้วย 2 กลวิธี 1) การปรับโครงสร้างของแอนติเจนด้วยการออกแบบให้ดีเอ็นเอวัคซีนเป็นแบบลูกผสมที่ใช้ส่วนที่สามของโปรตีนเปลือกหุ้มของเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 แทนที่ใน prM/E ของไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 2 ที่เป็นยีนแกนหลัก หรือเรียกว่า “chimeric D4EDIII-D2prME” 2) การเปลี่ยนสายพันธุ์ไวรัสอ้างอิงที่ใช้ในการทดสอบ plaque reduction neutralization test (PRNT): strain C0036 (เชื้อที่แยกได้ในปี 2006) กับ strain 1036 (เชื้อที่แยกได้ในปี 1976) การทดสอบการแสดงออกของโปรตีนใน Vero cells พบว่าดีเอ็นเอลูกผสม (chimeric D4EDIII-D2prME) ที่ได้พัฒนาขึ้น สามารถสร้างโปรตีนได้ในระดับที่ใกล้เคียงกันเมื่อเปรียบเทียบกับดีเอ็นเอต้นแบบของเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 2 (D2prME) และ ไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 (D4prME) การทดสอบประสิทธิภาพในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันในหนูทดลอง โดยการฉีดดีเอ็นเอลูกผสม และดีเอ็นเอต้นแบบของเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 ปริมาณ 25 g จานวน 3 ครั้ง ด้วยวิธี in vivo electroporation พบว่าเมื่อใช้เชื้อเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 strain 1036 ในการทดสอบ จะไม่สามารถตรวจพบ NtAb ของหนูที่ได้รับวัคซีนทั้งสองชนิดได้เลย แต่เมื่อเปลี่ยนมาใช้เชื้อเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 strain C0036 ในการทดสอบ พบว่าระดับของ NtAb เพิ่มสูงขึ้นอย่างมีนัยสาคัญทาง โดยมีค่า median PRNT50 เท่ากับ 80 และ 160 เมื่อได้รับดีเอ็นเอลูกผสม และดีเอ็นเอต้นแบบของเชื้อไวรัสเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 ตามลาดับ ดังนั้นเชื้อเด็งกี่ซีโรไทป์ 4 strain 1036 จึงไม่เหมาะสมในการนามาใช้เป็นไวรัสอ้างอิงที่ใช้ในการทดสอบ PRNT ในปัจจุบัน ผลจากการศึกษาครั้งนี้ แสดงให้เห็นถึงความจาเป็นในการตรวจสอบการวิวัฒนาการของเชื้อไวรัสเด็งกี่อย่างต่อเนื่อง ซึ่งอาจมีผลกระทบต่อการออกแบบเอนติเจนสาหรับดีเอ็นเอวัคซีน และการเลือกใช้ไวรัสสายพันธุ์อ้างอิงในการทดสอบ PRNT ต่อไปในอนาคต Several studies, including our dengue tetravalent DNA vaccine have been suffered from the lowest immunogenicity against dengue serotype-4 (DENV-4). This issue remains unexplained. In this study, two strategies were investigated to improve the DENV-4 immunogenicity: 1) restructuring the antigenic antigen by designing a new chimeric DENV-4 envelop glycoprotein domain III (EDIII) replaced in DENV-2 prM/E (D2prME) backbone (designated as “chimeric D4EDIII-D2prME”; 2) changing the DENV-4 reference strains that used in plaque reduction neutralization test (PRNT): the new strain C0036 (isolated year 2006) VS the old strain 1036 (isolated year 1976). In vitro protein expression in Vero cells showed that our chimeric D4EDIII-D2prME, D2prME and D4prME DNA vaccines produced the similar levels of E. The immunogenicity was evaluated by three times in vivo electroporation of 25 μg chimeric D4EDIII-D2prME or D4prME DNA vaccine in mice. By using an old DENV-4 reference strain 1036, PRNT50 titers were not detectable in any serum samples from mice immunized with both DNA vaccines. Surprisingly, the neutralizing antibody titers were significant increased by changing the reference virus to a new strain C0036. The median PRNT50 induced by the chimeric and original DNA vaccine were 80 and 160, respectively. It is evident that the DENV-4 strain 1036 is not suitable for currently PRNT assay. This study illustrates the need to continuously monitor the dengue viral evolution that might have a profound effect on the design of antigenic antigen using in the DNA vaccine and the choice of the reference strain in the PRNT assay in the future.