พยาธิใบไม้ติต่อผ่านปลาเป็นกลุ่มเชื้อปรสิตที่ยังคงมีความสำคัญทางการแพทย์ในหลาย ประเทศในเอเชีย โดยเฉพาะ พยาธิใบไม้ตับ ชนิด Opisthorchis viverrini ซึ่ง ไทป์ที่หนึ่ง ของ ตัวกระตุ้นให้เกิดมะเร็ง (type-1 carcinogen) สามารถกระตุ้นในเกิดมะเร็งท่อน้ำดี (cholangiocarcinoma) แม้ว่าตลอดระยะเวลาในการวางแผนควบคุมการติดเชื้อพยาธิชนิดนี้ จะมีการ รณรงค์การไม่บริโภคปลาดิบๆ สุกๆ แต่เนื่องจากค่านิยมการรับประทานอาหารของประชาชน โดยเฉพาะในแถบภาคเหนือและภาคตะวันออกเฉียงเหนือของไทย โดยเมตาเซอร์คาเรียซึ่งเป็นตัว อ่อนระยะก่อโรคจะฝังตัวอยู่ในเนื้อปลาและจะมีปริมาณสะสมในเนื้อปลามากโดยเฉพาะในช่วงปลาย ฤดูฝนถึงต้นฤดูร้อน การประเมินปริมาณการติดเชื้อเมตาเซอร์คาเรียในปลาน้ำจืดในพื้นที่ที่เป็นพื้นที่ ระบาดของ O. vivverini จึงเป็นอีกวิธีหนึ่งในการวางแผนการควบคุมการติดเชื้อพยาธิชนิดนี้ เนื่องจาก ปริมาณการติดเชื้อในแต่ละปีจะแปรผันมากน้อยตามปัจจัยทางธรรมชาติ เช่น น้ำท่วม หรือ ภาวะแล้ง ด้วยวิธีการที่ใช้ดั่งเดิม (tissue compression และ tissue digestion) เพื่อการตรวจการติดเชื้อในปลา นั้นมีข้อจำกัดในแง่ของเวลาและเป็นเทคนิคที่ต้องการกำลังคนและทักษะในการจัดจำแนกชนิดของ พยาธิจากเมตาเซอร์คาเรีย ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงพัฒนาเทคนิค Real-time multiplex PCR ซึ่งช่วยให้ สามารถลดเวลาและจัดจำแนกชนิดของพยาธิที่สนใจในเวลาอันรวดเร็วกว่า นอกจากนี้ยังสามารถ ประมาณจำนวนการติดเชื้อในปลาแต่ละตัวได้อย่างแม่นยำ โดยในงานวิจัยนี้ กำหนดชนิดพยาธิใบไม้ ที่สนใจ คือ O. viverrini Haplorchis taichui และ H. pumilio ซึ่งมักพบการติดเชื้อร่วมในปลาตัว เดียวกัน ซึ่งมักเป็นปัญหาในการจัดจำแนกเนื่องจากลักษณะสัณฐานภายนอกมีความคล้ายคลึงกัน โดยวิธีการที่ได้พัฒนานี้ สามารถแยกชนิดของเมตาเซอร์คาเรียและประมาณจำนวนเมตาเซอร์คาเรีย ตั้งแต่ 1 ถึง มากกว่า 20 เม็ด โดยสามารถเทียบกับ median cycle threshold ที่แสดงผลในการทำ 2 real time PCR อยู่ในช่วง Ct 35 ถึง Ct  24 ตามลำดับ จากวิธีที่พัฒนานี้สามารถเพิ่มความถูกต้อง ในการจัดจำแนกชนิดพยาธิและลดจำนวนกำลังคนในการตรวจหาเมตาเซอร์คาเรียในปลา โดยเฉพาะ อย่างยิ่ง ปลาที่มาจากบริเวณพื้นที่ซึ่งมีปริมาณการติดเชื้อสูง วิธีการนี้จึงเป็นทางเลือกของการประเมิน ปริมาณการติดเชื้อพยาธิ O. viverrini H. taichui และ H. pumilio ของปลาในพื้นที่ซึ่งพบการติดเชื้อ ร่วมของพยาธิที่ดังกล่าว Fish-borne zoonotic trematodes (FZT) remain a public health concern in many Asian countries, especially Opisthorchis viverrini, which is a known type-1 carcinogen that can induce cholangiocarcinoma. Despite a campaign to eat cooked fish dishes, the consumption of uncooked and undercooked fish dishes is still popular. Metacercarial-stage FZT infection of fish is largely seasonal. Periodic assessments of the degree of infection can inform FZT control programs of high levels of fish infection in endemic areas. Conventional methods (compression and digestion) used to detect and identify metacercariae in fish are ineffective, because they are time-consuming and require both manpower and metacercaria-identification skills. This study developed a new multiplex real-time quantitative PCR method for discriminating and quantifying the degree of infection with O. viverrini, Haplorchis taichui and Haplorchis pumilio. This method can distinguish and estimate the number of metacercariae with a median cycle threshold range of 1 to > 20 metacercariae (Ct 35 to Ct  24). The method proved more effective than conventional methods, with a high degree of accuracy, saving both skilled manpower and time for the study of FZT prevalence, especially in 4 endemic areas. Therefore, it might serve as an alternative method for detecting and quantifying metacercariae of O. viverrini, H. taichui, and H. pumilio in fish from endemic areas with evidence of co-infection.