มะเร็งท่อน้าดีซึ่งถือเป็นปัญหาทางสาธารณสุขที่ส้าคัญของประเทศไทยโดยเฉพาะในภาคตะวันออกเฉียงเหนือ แนวทางรักษามะเร็งท่อน้าดีในปัจจุบันได้แก่การผ่าตัด ซึ่งเป็นการรักษาแบบ curative และเมื่อใช้ร่วมกับการใช้ยาเคมีบ้าบัด พบว่าให้ผลดีกว่าการผ่าตัดเพียงอย่างเดียว แต่ก็ยังได้ผลไม่เป็นที่น่าพอใจนักต่อการเพิ่มอัตราการอยู่รอดของผู้ป่วย ดังนั นการศึกษาเพื่อหาแนวทางใหม่ๆในการรักษามะเร็งท่อน้าดีจึงถือเป็นสิ่งที่ท้าทายส้าหรับนักวิจัยและแพทย์ โดยการรักษาโรคมะเร็งในปัจจุบันเน้นไปที่การใช้ยาที่ออกฤทธิ์จ้าเพาะต่อโมเลกุลของมะเร็งที่เรียกว่าการรักษาแบบมุ่งเป้าหมาย (targeted therapy) และโปรตีนในกลุ่มไคเนส (kinase proteins) ได้ถูกน้ามาใช้เป็นเป้าหมายของยารักษาโรคมะเร็งหลายชนิดและมีแนวโน้มที่ได้ผลดี ดังนั นวัตถุประสงค์ของการวิจัยนี เพื่อศึกษาแบบแผนการกระตุ้นการท้างานของเอนไซม์ไคเนส และทดสอบประสิทธิภาพของการใช้สารยับยั งต่อกลุ่มเอนไซม์ไคเนส ในการยับยั งการเจริญเติบโตของเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดี จากผลกการตรวจสอบแบบแผนการกระตุ้นการท้างานของโปรตีนไคเนสโดยวิธี phospho RTK array และ phospho kinase array ในเนื อเยื่อและเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดี พบว่าในเนื อเยื่อผู้ป่วยและเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดี มีแบบแผนการกระตุ้นการท้างานของตัวรับและโปรตีนไคเนสได้หลาย pathway ประกอบด้วย PI3K-Akt, Ras-MAPK, JAK-STATและ Wnt-β-catenin ตามล้าดับ ซึ่งแต่ละ pathway มีบทบาทในการควบคุมการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของมะเร็งท่อน้าดีและน่าจะใช้เป็นเป้าหมายของยาในการรักษาผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดีในลักษณะที่เป็นการรักษาแบบมุ่งเป้า (targeted therapy) ได้ และได้ท้าการทดสอบประสิทธิภาพของยาในกลุ่ม kinase inhibitor หลายๆชนิดต่อการยับยั งการเจริญเติบโตของเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดีและพบว่ายา 2 ชนิดคือ sorafenib และ sunitinib ซึ่งเป็น multi-targeted kinase inhibitor มีประสิทธิภาพสูงกว่ายาตัวอื่นๆในกลุ่มที่ท้าการทดสอบ นอกจากนี ได้ศึกษาแบบแผนการแสดงออกของโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของวิถี PI3K/AKT ซึ่งประกอบด้วย PI3K regulatory subunit (p85α), PI3K catalyic subunit (p110α), AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR, GSK-3β, p-GSK-3β, PTEN และ p-PTEN ในเนื อเยื่อผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดี นอกจากนี ยังศึกษาผลของการใช้สารยับยั งวิถี PI3K/AKT ได้แก่ pan-class I PI3K inhibitor (NVP-BKM120) และ dual-PI3K/mTOR inhibitor (NVP-BEZ235) ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดี พบว่าร้อยละ 97 ของตัวอย่างของผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดีที่ศึกษามีการสูญเสียการท้างานของ PTEN ทั งโดยการที่ไม่การแสดงออกและถูกกดการท้างานโดยการเติมหมู่ฟอสเฟต พร้อมทั งพบการแสดงออกที่สูงขึ นของ PI3K คิดเป็นร้อยละ 90 ของผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดี ส่งผลให้มีการกระตุ้นวิถี PI3K/AKT สูงขึ นในตัวอย่างผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดี เป็นผลให้เกิดการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีโดยเฉพาะการแพร่กระจายของของเซลล์ฒะเร็ง ยิ่งไปกว่านั นยังพบว่า dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 มีฤทธิ์ในการยับยั งการเจริญเติบโตของเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดีได้ 3 Page3 และจากการศึกษาแบบแผนการแสดงออกของโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของวิถี Wnt/β-catenin รวมถึงบทบาทที่เกี่ยวข้องกับการเกิดมะเร็งท่อน้าดี พบว่าการแสดงออกของโปรตีนในกลุ่ม Wnt ที่พบว่ามีความสัมพันธ์กับโรคมะเร็งชนิดต่างๆจ้านวน 9 ชนิดด้วยเทคนิค quantitative real time RT-PCR ในตัวอย่างตับของผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดีพบว่ามีโปรตีน 5 ชนิด ได้แก่ Wnt1, Wnt3a, Wnt5a, Wnt7b และ Wnt8b ที่มีการแสดงออกที่เพิ่มสูงขึ นในเนื อเยื่อมะเร็งเมื่อเปรียบเทียบกับเนื อเยื่อตับปกติจากผู้ป่วยรายเดียวกันอย่างมีนัยส้าคัญ ในทางตรงกันข้ามพบว่าWnt3 นั นมีการแสดงออกที่ลดลงอย่างมีนัยส้าคัญ ส้าหรับการแสดงออกในเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดีนั นพบว่าเซลล์เพาะเลี ยงชนิด M156, M213 และ M214 มีการแสดงออกของ Wnt7a และ Wnt7b ในระดับที่สูง ในขณะที่ไม่พบการแสดงออกของโปรตีนสองชนิดนี ในเซลล์ M055 ส่วนโปรตีน Wnt ชนิดอื่นๆพบว่ามีการแสดงออกในระดับที่ต่้า ส้าหรับการศึกษาการแสดงออกของโปรตีน Wnt 4 ชนิด และโปรตีน β-catenin โดยวิธี immunohistochemistry พบการแสดงออกของโปรตีน Wnt3a, Wnt5a และ Wnt7b ในเซลล์มะเร็งท่อน้าดีคิดเป็น 92.5%, 77.5% และ 100% ของจ้านวนตัวอย่างทั งหมด 40 รายตามล้าดับ ในขณะที่พบว่าโปรตีน Wnt3 มีการแสดงออกส่วนใหญ่ที่ kupffer cell และกลุ่มเซลล์อักเสบ โดยที่พบการแสดงออกของโปรตีน Wnt3 ในเซลล์มะเร็งท่อน้าดีคิดเป็น 40% นอกจากนี ยังพบว่าการแสดงออกของโปรตีน Wnt5a มีความสัมพันธ์กับอัตราการรอดชีวิตของผู้ป่วยที่สั นลง ส้าหรับการแสดงออกของโปรตีน β-catenin นั นพบว่าเซลล์มะเร็งมีการแสดงออกของโปรตีนชนิดนี ลดลงที่บริเวณผนังเซลล์ โดยพบว่า 72.5% มีการแสดงออกของโปรตีนนี ที่บริเวณไซโตพลาสซึมและพบว่าการแสดงออกของ β-catenin มีความสัมพันธ์ในเชิงบวกกับการแสดงออกของโปรตีน Wnt3a และ Wnt5a อย่างมีนัยส้าคัญ (P = 0.017 และ 0.001, ตามล้าดับ) บ่งชี ถึงโมเลกุลที่ท้าหน้าที่ส่งสัญญาณควบคุมโปรตีน β-catenin ในมะเร็งท่อน้าดี นอกจากนี ในการศึกษาได้ท้าการตรวจสอบการแสดงออกของ Wnt3 ในเซลล์ macrophage หลังจากท้าการกระตุ้นด้วย LPS ซึ่งพบว่า LPS สามารถกระตุ้นให้มีการแสดงออกของ Wnt3 เพิ่มสูงขึ นทั งในระดับ mRNA และโปรตีน นอกจากนี ยังพบว่าน้าเลี ยงเซลล์ macrophage ที่ถูกกระตุ้นด้วย LPS สามารถกระตุ้นโปรตีน β-catenin ในเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดีได้ และในการศึกษาการท้างานของโปรตีน β-catenin ในมะเร็งท่อน้าดีนั น ได้ท้าการแทรกแซงการท้างานของ β-catenin ในเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดีด้วย siRNA ซึ่งพบว่ามีผลยับยั งการเจริญเติบโตของเซลล์เพาะเลี ยงมะเร็งท่อน้าดีอย่างมีนัยส้าคัญและสัมพันธ์กับการลดลงของยีนที่เป็นเป้าหมายของ β-catenin ซึ่งได้แก่ cyclin D1 อีกด้วย ซึ่งผลการศึกษาทั งหมดข้างต้นสนับสนุนว่าการแสดงออกที่ผิดปกติหรือการท้างานที่ผิดปกติของโปรตีนไคเนสหลายชนิดมีบทบาทในการควบคุมการเจริญเติบโตและการอยู่รอดของเซลล์มะเร็งท่อน้าดี และการยับยั งการท้างานของโปรตีนไคเนสเหล่านี ก็ส่งผลยับยั งการเจริญเติบโตและกระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งท่อน้าดีได้ ดังนั นจึงน่าจะน้ามาใช้เป็นกลยุทธ์หนึ่งในการรักษาผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดีทั งชนิดที่ใช้เป็นยาเดี่ยวหรือใช้ร่วมกับยาชนิดอื่นเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพในการรักษาผู้ป่วยมะเร็งท่อน้าดี Improving therapy for patients with cholangiocarcinoma (CCA) presents a significant challenge. This is made more difficult by a lack of a clear understanding of potential molecular targets, such as deregulated kinases. In this work, we profiled the activated kinases in CCA in order to apply them as the targets for CCA therapy. The present study, human phospho- receptor tyrosine kinases (RTKs) and phospho- kinase array analyses revealed that multiple kinases are activated in both CCA cell lines and human CCA tissues that included cell growth, apoptosis, cell to cell interaction, movement and angiogenesis RTKs. Predominately the kinases activated downstream were those in the PI3K/Akt, Ras/MAPK, JAK/STAT and Wnt/ β-catenin signaling pathways. Western blot analysis confirms that Erk1/2 and Akt activation were increased in CCA tissues when compared to their normal adjacent tissue. The inhibition of kinase activation using multitargeted kinase inhibitors, sorafenib and sunitinib led to significant cell growth inhibition and apoptosis induction via suppression of Erk1/2 and Akt activation while drugs with specificity to a single kinase showed less potency. Additionally, we also determined the expression levels of several key components of PI3K signaling and evaluated whether NVP-BEZ235, a novel dual PI3K/mTOR inhibitor could inhibit CCA cell growth. Immunohistochemistry for p85α, p110α, AKT, p-AKT (T308), mTOR, p-mTOR (S2448), GSK-3β, p-GSK-3β (S9), PTEN and p-PTEN (S380, T382/383) was performed in 30 CCA patients. Western blotting was used to analyze PTEN and p-PTEN expression in the cell lines. The effects of NVP-BEZ235 on CCA cells were evaluated using a growth inhibition assay, flow cytometer, migration assay. Increased activation of PI3K/AKT signaling was reproducibly observed in the CCA tissues. The expression of p85α, mTOR and GSK-3β was significantly correlated with metastasis. Interestingly, PTEN suppression by loss of expression or inactivation by phosphorylation was observed in the majority of patients. Furthermore, NVP-BEZ235 effectively inhibited CCA cell growth and migration through reduced AKT and mTOR phosphorylation and significantly induced G1 arrest without apoptosis induction, although, increase autophagy response was observed. 5 Page5 Furthermore, the quantitative real time RT-PCR demonstrated that Wnt3a, Wnt5a and Wnt7b mRNA were significantly higher in CCA tissues than adjacent non-tumor tissues and normal liver tissues, whereas Wnt3 was significantly lower in human CCA tissues. Immunohistocemical staining revealed that Wnt3a, Wnt5a and Wnt7b were positive in 92.5%, 77.5% and 100% of CCA tissues studied. Additionally, Wnt3 expression was mainly found in inflammatory cells, whereas cancer cells showed 40% positive staining. Furthermore, the expression of Wnt5a related to poor survival of CCA patients (P=0.007). Reduced membrane expression of β-catenin was observed in tumor area and 72.5% of CCA cases showed cytoplasmic β-catenin expression. Moreover, to test whether inflammation conditions involved in CCA development at least in part by activating Wnt/β-catenin signaling pathway, we investigated the expression of Wnt3 in macrophage cell line upon LPS stimulation. The result showed that LPS can induce the expression of Wnt3 both mRNA and protein levels in macrophage cell line. Moreover, conditioned media from LPS-induced activated macrophage can promote β-catenin accumulation in CCA cell lines. Furthermore transiently suppression of β-catenin by siRNA significantly induced growth inhibition of CCA cells, with an associated decrease in cyclin D1 expression. In conclusion, the present study reports the abundant expression of Wnt protein family and β-catenin in CCA as well as the role of inflammatory condition in Wnt/β-catenin activation in CCA cell lines. Importantly, abrogation of β-catenin expression caused significant CCA cell growth inhibition. Thus, Wnt/β-catenin signaling pathway may contributes to CCA cell proliferation and might be able to serve as a potential target for inhibiting CCA cell growth. Taken together, the data demonstrate that multiple protein kinases are activated which lead to stimulation of several signaling cascades in CCA. Therefore, targeting protein kinases is a promising strategy to improve CCA therapy.