จากรายงานการติดเชื้อพยาธิ echinostomes ในคนมีอยู่ด้วยกันหลายชนิดที่พบในประเทศไทย เช่น Echinostoma malayanum, Echinostoma revolutum, Echinoparyphium recurvatum และ Hypoderaeum conoideum ซึ่งการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิกลุ่มนี้ คือการเจอระยะไข่ ในอุจจาระของผู้ป่วย ไข่ของพยาธิกลุ่มนี้จะมีสัณฐานคล้ายกันมาก ไม่สามารถใช้จำแนกชนิดได้ อย่างไรก็ตามพบมีรายงานการใช้เครื่องหมายโมเลกุลในการจำแนกความแตกต่างทาง พันธุกรรมของพยาธิ echinostomes แต่ละชนิดได้อย่างมีประสิทธิภาพ ดังนั้นการศึกษาครั้งนี้จึง มุ่งเน้นที่จะพัฒนาการตรวจจำแนกด้วยวิธี multiplex PCR โดยทำการออกแบบ reverse primer ให้จำเพาะกับพยาธิ echinostomes ทั้ง 4 ชนิด โดยอาศัยตำแหน่งที่มีแตกต่างกันในพยาธิแต่ละ ชนิดของยีน NADH dehydrogenase subunit 1 เป็นตัวกำหนด ทำการทดสอบหาความจำเพาะ ของ primer กับเชื้อก่อโรคชนิดอื่นๆ ทั้งหนอนพยาธิ โปรโตซัวและแบคทีเรีย รวมทั้งทำการ ทดสอบความไวด้วย ผลการศึกษาพบว่า การทำ multiplex PCR จะให้ผลผลิต PCR ขนาด ต่างๆ กัน ได้แก่ E. revolutum มีขนาด 108 คู่เบส H. conoideum มีขนาด 209 คู่เบส E. recurvatum มีขนาด 378 คู่เบส และ E. malayanum มีขนาด 417 คู่เบส ผลการทดสอบ ความจำเพาะพบว่า primer มีความจำเพาะสูงร้อยละ 100 และมีความไวในการเพิ่มจำนวน ปริมาณ DNA ตั้งต้นที่ 0.1 ถึง 0.05 นาโนกรัม และยังสามารถตรวจสอบไข่พยาธิที่เติมไปใน ตัวอย่างอุจจาระ 100 กรัม ได้ในจำนวนเพียง 1 ไข่ ของพยาธิ E. revolutum และ H. conoideum ส่วนพยาธิ E. malayanum นั้นจะตรวจได้จำนวนตั้งแต่ 2 ไข่ขึ้นไป เทคนิคที่ พัฒนาขึ้นในการศึกษานี้ สามารถที่จะนำไปประยุกต์ใช้ในการตรวจจำแนกการติดเชื้อพยาธิ echinostomes ในเขตพื้นที่การระบาดในอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ยิ่งไปกว่านั้น ยังอาจนำไป ประยุกต์ใช้สำหรับการศึกษาระบาดวิทยาของพยาธิกลุ่มนี้ทั้งในสัตว์ป่าและสัตว์เลี้ยง There are several species of echinostomes that commonly infect humans in Thailand, e.g. Echinostoma revolutum, Echinostoma malayanum, Echinoparyphium recurvatum and Hypoderaeum conoideum. It is difficult if not impossible to differentiate among the eggs or immature stages of echinostome species using morphological characters. The variety of DNA sequences have been used effectively to differentiate among echinostome species. Thus this study aims to develop species specific primer for differential diagnosis of those four medically important echinostomes by multiplex PCR technique. The specific reverse primers of each species were designed from the variable regions of mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 1 gene. All four reverse primers together with a forward primer were used to amplify ND1 fragment. Specificity was tested with others pathogenic helminths, protozoa and bacteria available in the laboratory. Sensitivity of each primer was also evaluated. The different PCR product sizes, namely 108, 209, 387 and 417 bp were amplified by species specific primer of E. revolutum, H. conoideum, E. recurvatum and E. malayanum, respectively. No cross amplification between each species was observed. The specificity and sensitivity of each primer was very high at 100% and 0.1 to 0.05 ng, respectively. The assay system could detect each of a single echinostome egg in 100 mg of normal human feces for E. revolutum and H. conoideum, whereas E. malayanum could detect of two eggs. The species specific primers developed in this study could be consequently developed and used for potentially differential diagnosis of human echinostomiasis in Southeast Asia. Moreover, this multiplex PCR diagnosis could be fruitfully applied for epidemiology study in wild and domestic animals.