ที่มาของปัญหา: ภาวะโฮโมซัยกัสอัลฟาธาลัสซีเมีย (ฮีโมโกลบินบาร์ท) เป็นโรคถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่พบบ่อยที่สุดโรคหนึ่งในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้คู่สมรสที่เป็นพาหะของยีนอัลฟาธาลัสซีเมีย-1 ทั้งสองคนมีโอกาสทารกในครรภ์เป็นโรคดังกล่าวร้อยละ 25 ซึ่งเป็นผลจากการถ่ายทอดทางพันธุกรรมแบบยีนด้อย สตรีตั้งครรภ์ที่ทารกในครรภ์เป็นโรคฮีโมโกลบินบาร์ทมีความเสี่ยงที่จะเกิดภาวะแทรกซ้อน เช่น ครรภ์เป็นพิษ ตกเลือดหลังคลอด เพิ่มสูงขึ้น การตรวจวินิจฉัยก่อนคลอดของภาวะนี้ยังคงอาศัยการตรวจแบบรุกล้ำ เช่น การเจาะชิ้นเนื้อรก การเจาะน้ำคร่ำ หรือการเจาะเลือดจากสายสะดือทารกในครรภ์ ซึ่งการตรวจด้วยวิธีดังกล่าวมีความเสี่ยงต่อการแท้งบุตร มีรายงานการตรวจวินิจฉัยก่อนคลอดของโรคพันธุกรรมหลายโรคด้วยวิธีไม่รุกล้ำโดยใช้ cell-free DNA ของทารกที่อยู่ในพลาสมาของมารดา อย่างไรก็ดี มีเพียงไม่กี่รายงานที่ศึกษาการใช้ cell-free DNA ของทารกในพลาสมามารดาในการวินิจฉัยภาวะฮีโมโกลบินบาร์ท วัตถุประสงค์: เพื่อศึกษาความเป็นไปได้ของการใช้ cell-free DNA ของทารกในพลาสมามารดาในการวินิจฉัยทารกในครรภ์ที่มารดามีความเสี่ยงต่อการมีลูกเป็นฮีโมโกลบินบาร์ท วิธีดำเนินการวิจัย: คู่สมรสที่เป็นพาหะของยีนอัลฟาธาลัสซีเมียชนิด SEA deletion ได้รับการเชิญให้เข้าร่วมการวิจัยในวันที่มาขอรับการตรวจวินิจฉัยก่อนคลอด (ด้วยการเจาะชิ้นเนื้อรกหรือการเจาะเลือดจากสายสะดือทารกในครรภ์) สกัดพลาสมา DNA จากเลือดมารดา 10 มิลลิลิตร ทำ Real time quantitative PCR โดยใช้ probe ที่ติดฉลาก fluorescence ในการติดตาม wild type (wt) allele และ SEA allele ปริมาณการสร้างของแต่ละ allele จะได้รับการประเมินโดย cycle threshold (Ct) คำนวณความแตกต่างของ Ct (delta Ct) ของอาสาสมัครแต่ละราย (โดยคำนวณจาก Ct ของ wt allele ลบด้วย Ct ของ SEA allele) อาสาสมัครได้รับการตรวจวินิจฉัยก่อนคลอดด้วยวิธีมาตรฐานเพื่อวินิจฉัยทารกในครรภ์ว่าเป็น ฮีโมโกลบินบาร์ท พาหะชนิดอัลฟา หรือทารกปกติ ผลการศึกษา: ในการศึกษานี้มีทารกฮีโมโกลบินบาร์ท 62 ราย ทารกเป็นพาหะชนิดอัลฟา 62 ราย และทารกปกติ 25 ราย ค่าเฉลี่ยของ delta Ct เท่ากับ 1.04 +/-0.38, 0.21+/-0.37 และ 0.20+/-0.59 ในทารกฮีโมโกลบินบาร์ท, พาหะชนิดอัลฟา และทารกปกติ ตามลำดับ เมื่อใช้ Receiving Operating Curve (ROC) ค่า cut-off ที่ดีที่สุดของ delta Ct ในการทำนายทารกฮีโมโกลบินบาร์ท เท่ากับ 0.51 ซึ่งจะให้ความไวร้อยละ 98.4 และมีผลบวกลวงร้อยละ 23.0 ทารกฮีโมโกลบินบาร์ท 61 รายจาก 62 ราย (ร้อยละ 98.4) มีค่า delta Ct มากกว่า 0.51 ในขณะที่ทารกที่เป็นพาหะชนิดอัลฟาร้อยละ 74.2 และทารกปกติร้อยละ 84.0 มีค่า delta Ct ต่ำกว่า 0.51 เมื่อใช้ค่า delta Ct 0.51 เป็นค่า cut-off ในการทำนายภาวะฮีโมโกลบินบาร์ท จะมีความไวร้อยละ 98.4 ความจำเพาะร้อยละ 77.0 positive predictive value ร้อยละ 75.3 และ negative predictive value ร้อยละ 98.5 สรุป: ผลจากการศึกษานี้พบว่ามีแนวโน้มที่ดีในการใช้ cell-free DNA ของทารกในพลาสมามารดาในการตรวจวินิจฉัยก่อนคลอดสำหรับภาวะโฮโมซัยกัสอัลฟาธาลัสซีเมีย-1 (ฮีโมโกลบินบาร์ท) เมื่อใช้เทคนิคนี้ สองในสามของทารกที่ไม่เป็นโรคสามารถหลีกเลี่ยงการตรวจวินิจฉัยก่อนคลอดด้วยวิธีรุกล้ำและภาวะแทรกซ้อนที่อาจเกิดขึ้นได้ Background: Homozygous alpha-thalassemia (Hb Bart’s) is one of the most common inherited genetic diseases in Southeast Asia. Couples who both were the carrier of alpha-thalassemia 1 gene will have a 25% risk of having affected fetuses as a result of autosomal recessive inheritance. Pregnant women who carried Hb Bart’s fetuses will usually have increased risk for complications such as preeclampsia and postpartum hemorrhage. Prenatal diagnosis for this condition is still based on invasive procedures such as chorionic villus sampling (CVS), amniocentesis or fetal blood sampling (cordocentesis). These techniques accompanied with risk of fetal losses. Non-invasive prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA (cff-DNA) in maternal plasma had been reported in various genetic diseases. However, there were a few studies reported using cff-DNA in maternal plasma for diagnosis of Hb Bart’s. Objective: To investigate the possibility of using cell-free fetal DNA (cff-DNA) to determine the fetal status in pregnant women who were at risk of having Hb Bart’s fetuses. Material and Method: Couples who both were alpha-thalassemia carrier (SEA deletion) were invited to participate in the study at the time they came for prenatal diagnosis (chorionic villi sampling or fetal blood sampling). Plasma DNA was extracted from 10 mL of maternal blood. Real time quantitative PCR was performed using fluorescence-labeled probe to monitor wild type (wt) allele and SEA allele. The cycle threshold (Ct) was used to determine the quantity of each allele. Delta Ct (Ct of wt allele – Ct of SEA allele) was calculated from each sample. Prenatal diagnosis was performed using standard technique to determine fetal status (Hb Bart’s, alpha-trait, or normal). Result: There were 62 Hb Bart’s, 62 alpha-trait and 25 normal fetuses recruited into this study. Mean delta Ct was 1.04 +/-0.38, 0.21+/-0.37 and 0.20+/-0.59 in Hb Bart’s hydrops, alpha-trait and normal fetuses, respectively. Based on the Receiving Operating Curve (ROC) of delta Ct value, the best cut-off point for predicting Hb Bart’s hydrops was 0.51, which gave 98.4% sensitivity and a false-positive rate of 23.0%. All but one Hb Bart’s hydrops (98.4%) had delta Ct above 0.51, whereas 74.2% of alpha-trait and 84.0% of normal fetuses had delta Ct below 0.51. Using delta Ct 0.51 as a cut-off gave 98.4% sensitivity, 77.0% specificity, 75.3% positive predictive value and 98.5% negative predictive value. Conclusion: There is a positive trend to use cff- DNA in maternal plasma for prenatal diagnosis of homozygous alpha-thalassemia-1 (Hb Bart’s). With this technique, invasive prenatal testing and its complications can be avoided in approximately two-third of unaffected fetuses