Trypsin was purified to homogeneity from the viscera of hybrid catfish (Clarias macrocephalus × Clarias gariepinus) through ammonium sulfate fractionation and a series of chromatographies including Sephacryl S-200, Sephadex G-50 and DEAE-cellulose. It was purified to 47.6-fold with a yield of 12.7%. Based on native-PAGE, the purified trypsin showed a single band. The molecular mass of purified trypsin was estimated to be 24 kDa by size exclusion chromatography and SDS-PAGE. The optimum pH and temperature for Nα-p-tosyl-L-arginine methyl ester hydrochloride (TAME) hydrolysis were 8.0 and 60C, respectively. Trypsin was stable to heat treatment up to 50C, and over a pH range of 6.0-11.0. Trypsin was stabilized by calcium ion. The trypsin activity was strongly inhibited by soybean trypsin inhibitor and N-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone and partially inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid. Activity decreased continuously as NaCl concentration (0-30%) increased. Apparent Km value of trypsin was 0.3 mM and Kcat value was 92.1 S-1 for TAME. The N-terminal amino acid sequence of 20 residues of trypsin was IVGGYECQAHSQPPTVSLNA, which is highly homologous with trypsins from other fish species. Proteolytic activity of viscera extract from hybrid catfish (Clarias macrocephalus  Clarias gariepinus) was studied. The optimal pH and temperature were 9.0 and 50C, respectively, when toothed ponyfish (Gazza minuta) muscle was used as a substrate. When viscera extract from hybrid catfish was used for the production of protein hydrolysate from toothed ponyfish muscle, extract concentration, reaction time, and fish muscle/buffer ratio affected the hydrolysis and nitrogen recovery (NR) (p<0.05). Optimum conditions for toothed ponyfish muscle hydrolysis were 3.5% hybrid catfish viscera extract, 15 min reaction time and fish muscle/buffer ratio of 1:3 (w/v). High correlation between the degree of hydrolysis (DH) and NR (R2=0.974) was observed. Freeze-dried hydrolysate had a high protein content (89.02%, dry weight basis) and it was brownish yellow in color (L*=63.67, a*=6.33, b*=22.41). The protein hydrolysate contained a high amount of essential amino acids (48.22%) and had arginine and lysine as the dominant amino acids. Functional properties and antioxidative activities of a protein hydrolysate prepared from toothed ponyfish (Gazza minuta) muscle, using viscera extract from hybrid catfish (Clarias macrocephalus  Clarias gariepinus), with a degree of hydrolysis (DH) of 70%, were investigated. The protein hydrolysate had an excellent solubility (77%). The emulsifying activity index of the protein hydrolysate decreased with increasing concentration (p<0.05). Conversely, the foaming abilities increased as the hydrolysate concentrations increased (p<0.05). Protein hydrolysate exhibited the increases in 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzo-thiazothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging activities, ferric reducing power (FRAP) and metal chelating activity as hydrolysate concentration increased (p<0.05). Therefore, protein hydrolysate from the muscle of toothed ponyfish produced by viscera extract from hybrid catfish can be used as a promising source of functional peptides with antioxidant properties. เอนไซม์ทริปซินจากเครื่องในปลาดุกบิ๊กอุยสามารถทำบริสุทธิ์โดยการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตและการแยกด้วยโครมาโตกราฟีชนิดต่าง ๆ ได้แก่ Sephacryl S-200 Sephadex G-20 และ DEAE-cellulose โดยเอนไซม์ทริปซินมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 47.6 เท่าและได้ผลผลิตร้อยละ 12.7 เอนไซม์ทริปซินที่ผ่านการทำบริสุทธิ์ปรากฏเป็นแถบโปรตีนเดี่ยวบนเจลของ native-PAGE เอนไซม์ทริปซินที่ผ่านการทำบริสุทธิ์มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 24 กิโลดาลตัน เมื่อตรวจสอบด้วยวิธีเจลฟิวเตรชันและ SDS-PAGE พีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการย่อยสลาย Nα-p-tosyl-L-arginine methyl ester hydrochloride (TAME) คือพีเอช 8 และอุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เอนไซม์ทริปซินมีความคงตัวต่อความร้อนในช่วงอุณหภูมิไม่เกิน 50 องศาเซลเซียส และมีความคงตัวต่อพีเอชในช่วงพีเอช 6-11 แคลเซียมไอออนมีผลเพิ่มความคงตัวต่อเอนไซม์ทริปซิน กิจกรรมของเอนไซม์ทริปซินถูกยับยั้งอย่างมีประสิทธิภาพโดยสารยับยั้งเอนไซม์ทริปซินจากถั่วเหลือง และ N-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone และถูกยับยั้งบางส่วนโดย ethylenediaminetetraacetic acid กิจกรรมของเอนไซม์ทริปซินลดลงอย่างต่อเนื่องเมื่อความเข้มข้นของเกลือเพิ่มขึ้น (ร้อยละ 0-30) เอนไซม์ทริปซินมีค่า Km เท่ากับ 0.3 มิลลิโมลาร์ และ Kcat เท่ากับ 92.1 ต่อวินาทีสำหรับการย่อยสลาย TAME จากการตรวจสอบลำดับของกรดอะมิโนปลายสายด้านหมู่อะมิโนจำนวน 20 หน่วยย่อย พบว่าเอนไซม์ ทริปซินมีลำดับของกรดอะมิโนปลายสายด้านหมู่อะมิโน คือIVGGYECQAHSQPPTVSLNA ซึ่งมีลักษณะคล้ายกับเอนไซม์ทริปซินจากปลาชนิดอื่น ๆ จากการศึกษากิจกรรมของเอนไซม์โปรติเนสจากส่วนสกัดเครื่องในปลาดุกบิ๊กอุย (Clarias macrocephalus  Clarias gariepinus) พบว่าเอนไซม์มีพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการย่อยสลายกล้ามเนื้อปลาแป้นเขี้ยว (Gazza minuta) เท่ากับ 9.0 และ 50 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เมื่อศึกษาการใช้ส่วนสกัดเครื่องในปลาดุกบิ๊กอุยสำหรับการผลิตโปรตีนไฮโดรไลเสตจากกล้ามเนื้อปลาแป้นเขี้ยว พบว่า ความเข้มข้นของส่วนสกัด ระยะเวลาในการทำปฏิกิริยา และอัตราส่วนระหว่างกล้ามเนื้อปลาและบัฟเฟอร์ มีผลต่อระดับการย่อยสลายและการเก็บเกี่ยวไนโตรเจน (Nitrogen recovery, NR) (p<0.05) การใช้ส่วนสกัดเครื่องในปลาดุกบิ๊กอุยที่ระดับความเข้มข้นร้อยละ 3.5 โดยใช้ระยะเวลาในการย่อยสลาย 15 นาที และใช้อัตราส่วนระหว่างกล้ามเนื้อปลาและบัฟเฟอร์ เท่ากับ 1:3 (น้ำหนักต่อปริมาตร) เป็นสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการย่อยสลายโปรตีนกล้ามเนื้อปลาแป้นเขี้ยว ความสัมพันธ์ระหว่างระดับการย่อยสลาย (Degree of hydrolysis, DH) และ NR มีค่าสูง (R2 = 0.974) โปรตีนไฮโดรไลเสตจากกล้ามเนื้อปลาแป้นเขี้ยวที่ผ่านการทำแห้งโดยการระเหิดมีปริมาณโปรตีนสูง (ร้อยละ 89.02) และมีสีเหลืองอมน้ำตาล (L* = 63.67, a* = 6.33, b* = 22.41) นอกจากนี้โปรตีนไฮโดรไลเสต ประกอบด้วยกรดอะมิโนจำเป็นในปริมาณสูง (ร้อยละ 48.22) โดยเฉพาะอย่างยิ่งไลซีนและ อาร์จินีน จากการศึกษาสมบัติเชิงหน้าที่และกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของโปรตีนไฮโดรไลเสตจากกล้ามเนื้อปลาแป้นเขี้ยวที่ผ่านการเตรียมโดยใช้ส่วนสกัดเครื่องในปลาดุกบิ๊กอุยที่ระดับการย่อยสลาย ร้อยละ 70 พบว่า โปรตีนไฮโดรไลเสตสามารถละลายได้ดี (ร้อยละ 77) เมื่อความเข้มข้นของโปรตีนไฮโดรไลเสตเพิ่มขึ้นดัชนีกิจกรรมการเกิดอิมัลชันมีค่าลดลง (p<0.05) ส่วนความสามารถในการเกิดโฟมกลับมีค่าเพิ่มขึ้น นอกจากนี้เมื่อความเข้มข้นของโปรตีนไฮโดรไลเสตเพิ่มขึ้น กิจกรรมการจับอนุมูลอิสระ DPPH และ ABTS รีดิวซิงพาวเวอร์ และ กิจกรรมการจับโลหะเพิ่มขึ้น ดังนั้นโปรตีนไฮโดรไลเสตจากกล้ามเนื้อปลาแป้นเขี้ยวที่ผลิตโดยส่วนสกัดเครื่องในปลาดุกบิ๊กอุยสามารถใช้เป็นแหล่งของเปปไทด์ที่มีกิจกรรมการต้านอมุมูลอิสระที่มีศักยภาพ