A stable cholesterol biosensor was developed using gold nanoparticles (AgNP) modified boron-doped diamond (BDD) electrode through enzymetically generated hydrogen peroxide (H2O2). The gold nanoparticles (AuNP) were firstly electrodeposited at BDD electrode by cyclic voltammetry (CV) and were characterized using scanning electron microscopy (SEM). The AuNPs modified BDD electrode as catalytic for H2O2 determination was occurred oxidation peak at 0.9 V by cyclic voltammetry. Then, a self-assembled monolayer (SAM) of cysteine was adsorbed to AuNP, which yielded an interface containing amine groups and carboxyl groups for covalently attached with cholesterol oxidase (ChOx). The amine groups and carboxyl groups were characterized by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). A chronoamperometric measurement was carried out at AuNPs-BDD and ChOx-SAM-AuNPs-BDD electrodes for H2O2 and cholesterol determination, respectively. At an applied potential of 0.9 V (vs. Ag/AgCl), the AuNPs-BDD electrode and ChOx-SAM-AuNPs-BDD biosensor showed a low detection limit of 30 nM and 3 μM (S/N=3) with long linearity range of 100 nM - 2 mM and 10 μM – 2 mM of H2O2 and cholesterol determination, respectively. The cholesterol biosensor exhibited very stability (it can be used more than 20 times). It is interesting and promising to apply ChOx-SAM-AuNPs-BDD as a based sensor for a wide range of applications but the working potential too high for determination of cholesterol in real sample. So, the research was developed to ChOx/HRP-SAM-AuNPs-BDD using a mediator K4Fe(CN)6 at the concentration 1 mM. That can be decreased the working potential to 0.0 V. The HRP-SAM-AuNPs-BDD and ChOx/HRP-SAM-AuNPs-BDD biosensors showed a low detection limit of 3.5 μM (S/N=3) H2O2 and 10 μM (S/N=3) Cholesterol with long linearity range of 10 μM - 3 mM and 10 μM – 1.5 mM. This biosensor exhibited good reproducibility (RSD lower than 9 %) and very stability (it can be used more than 15 weeks). Moreover, it can be determined cholesterol in the serum sample and received 103% and 96% recovery at the concentration 0.5 and 1.0 mM, respectively. การพัฒนาคอเลสเตอรอล (cholesterol) ไบโอเซนเซอร์โดยการใช้ขั้วไฟฟ้าฟิล์มบางเพชรเจือโบรอน (BDD) ที่ดัดแปรด้วยอนุภาคทองระดับนาโน (AuNPs) ผ่านการเกิดปฏิกิริยากับเอนไซม์คอเลสเตอรอลออกซิเดส (ChOx) ได้ผลิตภัณฑ์เป็นไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) อนุภาคทองระดับนาโนถุกยึดติดบนขั้วไฟฟ้าด้วยเทคนิคไซคลิกโวลแทมเมตริก และตรวจสอบคุณลักษณะด้วยเครื่อง SEM/EDX อนุภาคทองนาโนบนขั้วไฟฟ้า BDD จะมีคุณสมบัติในการเร่งการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของ H2O2 ปรากฎที่ 0.9 V โดยเทคนิคไซคลิกโวลแทมเมทริก SAM จะเป็นชั้นของกลุ่มไทออลจากคีสเตอีนที่สามารถดูดซับอยู่บนพื้นผิวทองอนุภาคนาโนได้อย่างแนบแน่น โดย SAM จากคีสเตอีนนี้จะประกอบไปด้วยหมู่ฟังก์ชันของเอมีน และคาร์บอกซิลเหมาะอย่างยิ่งต่อการจับกับเอนไซม์ด้วยพันธะโควาเลนต์ ตรวจสอบคุณลักษณะของหมู่ฟังก์ชันด้วยเครื่อง XPS การตรวจวัดด้วยเทคนิคโครโนแอมเปอร์โรเมทริกจะใช้สำหรับการหาปริมาณ H2O2 และ cholesterol บนขั้วไฟฟ้า AuNPs-BDD และ ChOx-SAM-AuNPs-BDD ตามลำดับ โดยทำการตรวจวัดที่ศักย์ไฟฟ้า 0.9 V (vs. Ag/AgCl) ผลที่ได้พบว่าช่วงความสัมพันธ์ที่เป็นเส้นตรงของ H2O2 และ cholesterol อยู่ที่ 100 nM - 2 mM และ 10 μM – 2 mM ขีดจำกัดของการตรวจวัดอยู่ที่ 30 nM และ 3 μM (S/N=3) ตามลำดับ อายุการใช้งานของขั้วไฟฟ้าสามารถทำการตรวจวัดได้มากกว่า 20 ครั้ง แต่เนื่องจากศักย์ไฟฟ้าในการตรวจวัดสูง 0.9 V จึงทำให้มีปัญหาในการตรวจวัดในตัวอย่างจริง ดังนั้นคณะผู้วิจัยจึงนำตัวกลางการให้สัญญาณทางเคมีไฟฟ้าเข้ามาช่วยคือ K4Fe(CN)6 ใช้ที่ความเข้มข้น 1 mM และใช้ศักย์ไฟฟ้าในการตรวจวัดได้ต่ำถึง 0.0 V บนขั้วไฟฟ้า ChOx/HRP-SAM-AuNPs-BDD biosensor พบว่าขั้วไฟฟ้าที่สร้างขึ้น HRP-SAM-AuNPs-BDD และ ChOx/HRP-SAM-AuNPs-BDD biosensor มีขีดจำกัดในการตรวจวัดต่ำถึง 3.5 μM และ 10 μM มีช่วงของความสัมพันธ์ที่เป็นเส้นตรงอยู่ที่ 10 μM - 3 mM และ 10 μM – 1.5 mM สำหรับของ H2O2 และ cholesterol ตามลำดับ ขั้วไฟฟ้าที่สร้างขึ้นนี้มีความสามารถในการวัดซ้ำได้ค่า %RSD ต่ำกว่า 9 เมื่อตรวจวัดบนขั้วเดียวกันและต่างขั้วไฟฟ้ากัน (n=5) อายุการใช้งานมากกว่า 15 สัปดาห์ มีความสามารถนำประยุกต์ใช้ตรวจวัดในตัวอย่างจริง และเมื่อนำไปหาเปอร์เซนต์การกลับคืนได้ 103% และ 96% ที่ความเข้มข้นของ cholesterol 0.5 และ 1.0 mM ตามลำดับ