การแสดงออกอย่างต่อเนื่องตลอดเวลาของ Pichia pastoris โดยใช้โปรโมเตอร์ GAP เป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการหลีกเลี่ยงการใช้เมทานอลเป็นตัวเหนี่ยวนำในกรณีที่ใช้โปรโมเตอร์ AOX1 ทั้งนี้ โปรโม-เตอร์ GAP สามารถแสดงออกได้สูงเมื่อเชื้อเจริญโดยใช้กลูโคสเป็นสับสเทรตเปรียบเทียบกับกลีเซอ-รอลหรือเมทานอล อย่างไรก็ตาม มีการรายงานว่าการใช้กลีเซอรอลซึ่งเป็นน้ำตาลที่ไม่สามารถเกิดการหมักได้ในการเพาะเลี้ยง P. pastoris จะสามารถตรวจพบการสร้าง by-product ในรูปเอทานอลได้ โดยเอทานอลที่เกิดขึ้นสามารถกดดันการแสดงออกของโปรโมเตอร์ AOX1 ทำให้การแสดงออกของโปรโมเตอร์ AOX1 ต่ำลง ทั้งนี้ ในปัจจุบันยังไม่พบการรายงานถึงการผลิต by-product ในรูปเอทานอล เมื่อทำการเพาะเลี้ยง P. pastoris โดยใช้กลูโคสเป็นสับ-สเทรต หรืออิทธิพลของเอทานอลต่อการการแสดงออกของโปรโมเตอร์ GAP ดังนั้น งานวิจัยนี้จึงมุ่งเน้นการศึกษาในประเด็นดังกล่าว โดยใช้เอนไซม์เบต้ากลูโคสิเดสเป็นโปรตีนติดตาม เพื่อศึกษาการแสดงออกของโปรโมเตอร์ GAP ซึ่งจากการทดลองพบว่าการเติมเอทานอลในอาหารเลี้ยงเชื้อ มีผลทำให้ความหนาแน่นของเซลล์ อัตราการเติบโตจำเพาะ (μ) และกิจกรรมของเบต้ากลูโคสิเดส ลดลง จากผลที่ได้แสดงว่าเอทานอลสามารถยับยั้งการเติบโตและแสดงออกของโปรโมเตอร์ GAP จากนั้นจึงทำการศึกษาอิทธิพลของความเข้มข้นของกลูโคสเริ่มต้นในกระบวนการหมักแบบแบตช์ ภายใต้สภาวะไม่จำกัดออกซิเจน (DOT > 25%) พบว่าความเข้มข้นกลูโคสเริ่มต้นที่เหมาะสม คือ 20 กรัมต่อลิตร ซึ่งทำให้ได้ค่า μ = 0.20 ชม-1 และระยะเวลาที่ใช้ในช่วงการปรับตัวเท่ากับ 3.99 ชั่วโมง ซึ่งการเพิ่มความเข้มข้นของกลูโคสเป็น 60 และ 80 กรัมต่อลิตร จะทำให้เกิดการสร้างเอทานอล ส่งผลทำให้ค่า μ ลดลง และระยะเวลาที่ใช้ในช่วงการปรับตัวนานขึ้น ซึ่งเป็นการแสดงให้เห็นว่าเอทานอลที่เกิดขึ้นภายใต้สภาวะไม่จำกัดออกซิเจนเกิดขึ้นโดยวิถี over-flow ในส่วนสุดท้ายของงานวิจัยนี้ ได้ทำการออกแบบระบบการเพาะเลี้ยงแบบเฟด-แบตช์ 4 ระบบ เพื่อหาสภาวะควบคุมที่เหมาะสมโดยมุ่งเน้นการศึกษาปัจจัยของความเข้มข้นของกลูโคสและค่าออกซิเจนละลายเป็นหลัก คือ ระบบที่ 1 กลูโคสและออกซิเจนจำกัด ระบบที่ 2 กลูโคสจำกัดแต่ออกซิเจนไม่จำกัด (DOT > 25%) ระบบที่ 3 กลูโคสไม่จำกัด ([กลูโคส]  10 กรัมต่อลิตร) และออกซิเจนจำกัด และระบบที่ 4 กลูโคสและออกซิเจนไม่จำกัด จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า สภาวะจำกัดออกซิเจนเป็นปัจจัยหลัก ที่ทำให้การเติบโตและการแสดงออกของโปรโมเตอร์ GAP ลดลง รวมถึงพบการสร้างเอทานอลปริมาณมาก (13.5-14.0 กรัมต่อลิตร) ภายใต้สภาวะจำกัดออกซิเจนเปรียบเทียบกับสภาวะไม่จำกัดออกซิเจน (0.6 กรัมต่อลิตร) เอทานอลที่ความเข้มข้นสูงส่งผลให้ค่า μ ลดลงประมาณ 35% และ 63% เมื่อเปรียบเทียบระบบที่ 1 กับระบบที่ 2 และระบบที่ 3 กับระบบที่ 4 ตามลำดับ ยิ่งไปกว่านั้น พบว่าอัตราการสร้างผลผลิตจำเพาะในระบบที่ไม่จำกัดออกซิเจน จะสูงกว่าในระบบที่จำกัดออกซิเจน ประมาณ 7 เท่า โดยพบว่าระบบที่เหมาะสมที่สุด คือ ระบบที่ 4 อย่างไรก็ตาม ระบบที่ 4 จะควบคุมได้ยากภายใต้สภาวะที่ความหนาแน่นของเซลล์สูง ดังนั้น ผู้วิจัยจึงแนะนำระบบที่ 2 คือ กลูโคสจำกัดและออกซิเจนไม่จำกัด สำหรับการแสดงออกของรีคอมบิแนนท์โปรตีนใน P. pastoris ที่ใช้โปรโมเตอร์ GAP เป็นตัวควบคุมการแสดงออกแบบต่อเนื่องตลอดเวลา Constitutive protein expression in Pichia pastoris using the GAP promoter to avoid the use of methanol is an effective alternative to the inducible AOX1 promoter. GAP promoter is a strong constitutive promoter that shows high expression when cells are grown on glucose. When P. pastoris are grown on glycerol, the non-fermentable sugar, small amount of ethanol can be detected. Ethanol has been reported to repress the AOX1 promoter resulting in lower expression level of recombinant protein. However, no literature has reported on the production of ethanol by-product when P. pastoris are grown on glucose or the effect of ethanol on the expression of GAP promoter. In this work, first, the effect of ethanol on the growth and expression of GAP promoter were investigated using μ -glucosidase as a reporter protein. The present of ethanol in culture medium decreased the cell concentration, specific growth rate (μ) and μ -glucosidase activity. These results indicated that ethanol inhibit the cell growth and also the expression of the GAP promoter. Then, the influence of initial glucose concentration was studied under oxygen non-limit condition (DOT > 25 %). The optimum initial glucose concentration of 20 g/L provides μ = 0.20 h-1 and lag time of 3.99 h. The increase of initial glucose concentration to 60 and 80 g/L resulted in the accumulation of ethanol, which decrease μ and increased the lag time. These results indicated that under oxygen non-limit condition, the ethanol was produced via overflow metabolism. Finally, 4 fed-batch systems were designed base on the effect of glucose concentration and DOT to find the optimum fed-batch control (system I: glucose and oxygen limit, system II: glucose limit and oxygen non-limit (DOT > 25%), system III: glucose non-limit ([glu]  10 g/L) and oxygen limit), and system IV: glucose and oxygen non-limit). The results showed that the oxygen limitation had a major drawback effect to both cell growth and expression of the GAP promoter. More ethanol by product was accumulated under the oxygen limited condition (13.5-14.0 g/L) compare to the oxygen non-limited condition (0.6 g/L). The higher ethanol concentration results in the decrease of μ about 35% and 63% when compared system I with system II and system III with system IV, respectively. Furthermore, about 7 times higher specific production rate was observed under non-oxygen limit condition compared with oxygen limitation. The best results were obtained when system IV was used, however, the system IV is very difficult to control under high cell density culture. Therefore, we recommended system II of glucose limit and oxygen non-limit for the constitutive expression process of P. pastoris using glucose as substrate.