งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อทำการแยกพลาสมิดขนาดเล็กจากเชื้อ Lactobacillus ที่แยกได้จากตัว อย่างอาหารเพื่อนำมาพัฒนาใช้เป็นเวคเตอร์ชนิดที่เป็น food grade ที่ใช้ในการโคลนยีนสำหรับเชื้อ Lactobacillus และเชื้อสายพันธุ์ใกล้เคียง นอกจากนี้ยังได้ทำการศึกษายีนที่ควบคุมการต้านทานโลหะหนักจากแบคทีเรียแลคติก เพื่อนำมาใช้เป็นยีน selection markers ทดแทนยีนต้านทานยาปฏิชีวนะ ได้ทำการแยกเชื้อ Lactobacillus จากตัวอย่างอาหารได้ 174 ไอโซเลต จากการศึกษารูปแบบของพลาสมิด (plasmid profile) ได้เลือกเชื้อที่มีพลาสมิดขนาดเล็กซึ่งแยกได้จากแหนม และจัดจำแนกเชื้อได้เป็น Lactobacillus plantarum โดยให้ชื่อว่า L. plantarum KM1 ทำการแยกพลาสมิดขนาดประมาณ 3.0 กิโลเบส และให้ชื่อพลาสมิดว่า pKM1 จากการศึกษาลำดับนิวคลีโอไทด์พบ open reading frame 2 ชนิด ซึ่งเมื่อศึกษาลำดับกรดอะมิโนจากลำดับนิวคลีโอไทด์ พบว่า ORF1 และ ORF2 มีลำดับกรดอะมิโนคล้ายโปรตีน mobilization (Mob) และ replication (RepA) ตามลำดับ โดยมีลำดับกรดอะมิโนคล้ายกับโปรตีนที่พบบนพลาสมิดที่มีการจำลองตัวแบบ rolling circle จากแบคทีเรียแลคติกหลายชนิดเช่น พลาสมิด pLC88, pRS4, pF8801, pWCFS101 และ pRS4 นอกจากนี้ยังพบตำแหน่งที่เรียกว่า double strand origin (dso) และ single stand origin (sso) ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของพลาสมิดที่มีการจำลองตัวเองแบบ rolling circle ดังนั้นพลาสมิด pKM1 จึงจัดเป็นพลาสมิดชนิด rolling circle และจากการที่พลาสมิด pKM1 มีตำแหน่งที่สามารถตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะที่สามารถใช้ในการตัดต่อยีนได้จึงสามารถนำมาพัฒนาสร้างเป็นเวคเตอร์สำหรับการโคลนยีนสำหรับ Lactobacillus ได้ จากการคัดเลือกเชื้อที่ต้านทานโลหะหนักพบเชื้อสามารถต้านทานนิกเกิล 20 mM คอปเปอร์ 200 mM และแคดเมียม 1 mM จำนวน 61, 45 และ12 ไอโซเลต ตามลำดับ การทำ plasmid curing โดยใช้สารnovobiocin ร่วมกับการใช้อุณหภูมิสูงไม่สามารถแยกชิ้นพลาสมิดที่มียีนควบคุมการต้านทานโลหะหนักได้ การศึกษายีนต้านทานแคดเมียมด้วยเทคนิค PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะกับยีน cadA ซึ่งควบคุมการต้านทานแคดเมียมพบว่าสามารถแยกชิ้นดีเอ็นเอที่เป็นผลผลิต PCR ขนาดประมาณ 600 คู่เบส จากการใช้พลาสมิดและโครโมโซมเป็นแม่แบบ และจากการศึกษาลำดับเบสบนผลลผลิต PCR พบว่าคล้ายกับยีน cadA บนพลาสมิดหลายชนิดจากแบคทีเรียแลคติก ได้แก่พลาสมิด pGdh 442, pNP40, pAH82, pAG6, pND302 และ pLI100 การหาชิ้นของพลาสมิดที่มียีนควบคุมการต้านทานแคดเมียมโดยวิธี Southern hybridization โดยใช้โพรบที่จำเพาะกับยีน cadA และ cadC พบพลาสมิดจากเชื้อ V13, C53 และ NU1 ที่มียีนต้านทานแคดเมียมคล้ายกับยีน cadA The aim of this work was to isolate a small cryptic plasmid from Lactobacillus isolated from food samples to be used as a food grade cloning vector for Lactobacilli and related strains. Metal resistance determinants, such as nickel, copper and cadmium from lactic acid bacteria were also studied in order to use those resistance genes as food grade selection markers to replace antibiotic resistance markers. A total of 174 Lactobacillus strains were isolated from food samples. One isolate from Nham identified as Lactobacillus plantarum (designated L. plantarum KM1) was chosen as it contains small plasmid. A small 3-กิโลเบส plasmid namely pKM1 was isolated from L. platarum KM 1 for sequencing. Sequence analysis revealed two open reading frames (ORFs). The deduced amino acid sequence encoded by ORF1 and ORF2 showed high degrees of sequence homology to the Mob and Rep proteins, respectively, of a numbers of rolling circle plasmids from lactic acid bacteria such as pLC88, pRS4, pF8801, pWCFS101 and pRS4. Two conserved sequences of dso (double strand origin) and sso (single strand origin) characteristic of rolling circle plasmid were also identified upstream of ORF2. Therefore, pKM1 from L. plantarun KM1 could be classified as rolling circle type plasmid that can be used to construct a cloning vector for Lactobacilli. Screening of metal ion resistance lactic acid bacteria was carried out and the results showed that 61, 45 and 12 isolates could resistance to copper sulfate, nickel sulfate and cadmium chloride to up to 20, 200 and 1 mM, respectively. Plasmid curing using novobiocin and high temperature was failed to identify plasmid harboring metal resistance determinants. The genes responsible for cadmium resistance therefore were identified by PCR using primers specific to cadA gene. About 600 bp PCR products were obtained and subjected to direct sequencing analysis. A homology search revealed sequence similarity to cadA gene on plasmids pGdh 442, pNP40, pAH82, pAG6, pND302 and pLI100 from a number of lactic acid bacteria. Southern hybridization cadA specific probe was carried out to localize cadmium resistance determinants plasmids. Positive signals were detected from 3 isolates C53, V13 and NU1.