Acetyl-CoA carboxylase เป็นเอนไซม์ที่มีความสำคัญในการเร่งปฏิกิริยา carboxylation ของacetyl-CoA ไปเป็น malonyl-CoA ในกระบวนการสังเคราะห์กรดไขมันสายยาวในสิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่ แต่เอนไซม์นี้ทำหน้าที่ตรึงก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ในสิ่งมีชีวิตพวกอาร์เคีย เอนไซม์บริสุทธิ์ที่แยกได้จากสัตว์และแบคทีเรียจะมีกิจกรรมลดลงในเวลาเพียงไม่กี่นาทีเมื่อนำไปบ่มที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส นอกจากนี้ ความคงตัวที่อุณหภูมิสูงของเอนไซม์ซึ่งแยกได้จากอาร์เคีย (Acidianus และ Metallosphaera) ยังต่ำกว่าอุณหภูมิที่มันเจริญอยู่ งานวิจัยนี้มีจุดมุ่งหมายที่จะแยกเอนไซม์ acetyl-CoA carboxylase จากแบคทีเรียสังเคราะห์แสงในบ่อน้ำร้อนให้บริสุทธิ์ แบคทีเรียสังเคราะห์แสงไอโซเลท TWC12 เป็นแบคทีเรียสีม่วงที่สะสมเม็ดกำมะถันในเซลล์ เจริญได้ที่อุณหภูมิสูงปานกลาง เชื้อนี้แยกได้จากตัวอย่างดินโคลน และน้ำบริเวณบ่อน้ำร้อนในจังหวัดแพร่ แบคทีเรียสามารถเจริญได้เร็วที่ช่วงอุณหภูมิ 50-59 องศาเซลเซียส โดยมี pyruvate เป็นแหล่งคาร์บอนที่ดีสำหรับการเจริญ และมีซัลไฟด์เป็นตัวให้อิเลคตรอน แบคทีเรียชนิดนี้จัดอยู่ในกลุ่ม purple sulfur bacteria เนื่องจากมีการสะสมเม็ดกำมะถันภายในเซลล์เมื่อเลี้ยงเชื้อในสภาพไร้อากาศ-มีแสง เมื่อเชื้อเจริญในสภาพที่มีแสง อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส เชื้อจะมีสีแดงเพราะเซลล์มีการสังเคราะห์คาโรทีนอยด์ แบคทีเรียนี้ไม่สามารถเจริญได้ในสภาพการเลี้ยงเชื้อแบบมีอากาศ-ไม่มีแสง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียสังเคราะห์แสงไอโซเลท TWC12 เป็นเชื้อที่ต้องการแสงในการเจริญ และต้องการอากาศในปริมาณที่น้อยมาก เชื้อเจริญได้เร็วในอาหารที่มี pyruvate เป็นแหล่งคาร์บอน แต่เจริญได้ค่อนข้างช้าในอาหารที่มี acetate, malate และ succinate เชื้อไม่สามารถเจริญได้ในอาหารที่เติม glucose, fructose, glutamate, propionate และ butyrate แบคทีเรียสังเคราะห์แสงไอโซเลท TWC12 มีลักษณะคล้ายคลึงกับ Thermochromatium tepidum ซึ่งเป็นแบคทีเรียสังเคราะห์แสงที่ชอบอุณหภูมิสูงพบได้ในน้ำพุร้อน Mammoth ของอุทยานแห่งชาติ Yellowstone (Madigan, 1986) การตรวจนับจำนวนโปรตีนที่มีหมู่ biotin ในเซลล์แบคทีเรียสังเคราะห์แสงไอโซเลท TWC12 ทำได้ด้วยการเพาะเลี้ยงเชื้อในสภาพ photoheterotrophic condition ที่มี pyruvate เป็นแหล่งคาร์บอน อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส นำโปรตีนภายในเซลล์มาแยกด้วยกระแสไฟฟ้าด้วยวิธี SDS-PAGE (10% gel) โปรตีนที่มีหมู่ biotin ถูกตรวจสอบด้วยการทำ Western blot ที่ใช้ avidin-HRP conjugate เป็นโปรตีนสำหรับตรวจวัด ผลการทดลองพบว่า ภายในเซลล์แบคทีเรียสังเคราะห์แสงไอโซเลท TWC12 มีจำนวนโปรตีนที่มีหมู่ biotin เพียง 1 ชนิดเท่านั้นซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 22 kDa ซึ่งโปรตีนนี้อาจเป็น biotin-carboxyl-carrier protein ของเอนไซม์ acetyl-CoA carboxylase ที่สามารถพบได้เป็นส่วนใหญ่ในแบคทีเรีย และในอาร์เคียบางชนิด เอนไซม์ acetyl-CoA carboxylase จากเซลล์แบคทีเรียสังเคราะห์แสงไอโซเลท TWC12 ที่เจริญในสภาพ photoautotrophic และ photoheterotrophic conditions นี้ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วย streptavidin column เอนไซม์จะถูกชะออกมาจากคอลัมน์ด้วยบัพเฟอร์ที่มี D-biotin ความเข้มข้น 5.0 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร fraction ที่เก็บได้ 1 มิลลิลิตรจำนวน 40 fractions จะถูกนำมาตรวจสอบโปรตีนด้วยวิธี SDS-PAGE (12% gel) อย่างไรก็ตาม ไม่สามารถตรวจพบโปรตีนชนิดใด ๆใน fractions ที่เก็บได้ แม้จะเพิ่มปริมาณเซลล์ที่นำมาสกัดเอนไซม์มากถึง 27 กรัม (น้ำหนักสด) ซึ่งอาจเป็นไปได้ว่ามีปัญหาเกี่ยวกับ affinity column ที่ใช้ หรืออาจเกิดจากคุณภาพของ D-biotin ที่ใช้ในการชะเอนไซม์ออกมาจากคอลัมน์ Acetyl-CoA carboxylase is a crucial enzyme that catalyzes the carboxylation reaction of acetyl-CoA to form malonyl-CoA in the first step of a straight-chain fatty acid biosynthesis in most organisms whereas it plays an important role as a carboxylating enzyme of the new CO2 fixation pathway in archaea. However, the activity of the purified enzymes from animals and bacteria drastically decreased within a few minutes when the enzymes were incubated at 42 C. In addition, the thermostability of the purified enzymes from the thermophilic archaea (Acidianus and Metallosphaera) is less stable than their growth temperatures. In this research, we aim to purify and characterize the acetyl-CoA carboxylase from a thermophilic photosynthetic bacterium in hot well. A purple sulfur bacterium isolate TWC12 is a moderately thermophilic photosynthetic bacterium that was isolated from mud and water samples around hot wells in Phrae province. The isolate TWC12 was capable of rapid growth at temperature ranging from 50 to 59 C and utilize pyruvate as a good carbon source and sulfide as an electron donor. The bacterium was classified to be in a group of purple sulfur bacteria based on the presence of intracellular sulfur globules when the cultures were grown under anaerobic-light condition. The color of the photosynthetically grown cells at 55 C was red due to the production of carotenoids as its pigment. The bacterium was unable to grow under aerobic and dark conditions. The results indicated that the isolate TWC12 is an obligate phototroph and a microaerophile. The bacterium grew quickly when pyruvate was metabolized as a carbon source whereas slow growth was occurred under photoassimilation of acetate, malate and succinate. No growth was observed when glucose, fructose, glutamate, propionate or butyrate was added in the medium. The culture characteristics of TWC12 are similar to Thermochromatium tepidum, a thermophilic photosynthetic bacterium from Mammoth hot springs in Yellowstone national park (Madigan, 1986). To determine the number of biotin-containing proteins in the cell extract of TWC12, the bacterium was grown under photoheterotrophic condition at 55 C using pyruvate as a carbon source. The intracellular proteins were separated by 10% gel of SDS-PAGE. The biotin-containing proteins were detected by Western blot using an avidin-HRP conjugate as a protein probe. The result showed that a single biotinylated protein band was present which had the molecular weight of approximately 22 kDa. It was indicated the possible biotin-carboxyl-carrier protein (BCCP), a small subunit of acetyl-CoA carboxylase in the cells that was also found in most bacteria and some archaea. The acetyl-CoA carboxylase from the isolate TWC12 was purified by a 1 ml Hi-Trap streptavidin column chromatography using the growing cells under photoautotrophic and photoheterotrophic conditions. The purified enzyme was eluted from the column with a buffer containing 5 mg/ml D-biotin. Fractions of approximately 1 ml were collected (40 column volume) and analyzed by SDS-PAGE (12%). However, none of the protein in any fraction was detectable although the cell mass for enzyme purification was increased up to 27 g wet cell weight. It might be that there were some problems with the affinity column or the quanlity of D-biotin for enzyme elution.