Infectious hypodermal and hematopoietic necorsis virus (IHHNV) หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) เป็นไวรัสสำคัญชนิดหนึ่งที่ก่อโรคในกุ้ง ทำให้เกิดความเสียหายแก่การผลิตและราคาของกุ้ง การติดไวรัส IHHNV ในกุ้งขาว (Penaeus vannamei) ทำให้เกิดโรค runt deformity syndrome ซึ่งกุ้งจะโตช้าและมีรูปร่างผิดปกติ การใช้อาร์เอ็นสายคู่โดยอาศัยกระบวนการ RNA interference นับเป็นเทคโนโลยีใหม่ที่สามารถป้องกันการติดไวรัสในกุ้งได้ โครงการนี้จึงต้องการทดสอบการใช้อาร์เอ็นสายคู่ที่จำเพาะต่อยีนของ IHHNV ในการยับยั้งการจำลองตัวของไวรัสเพื่อการป้องกันและการรักษากุ้งที่ติด IHHNV ในเบื้องต้นพบว่าการฉีดสารสกัดที่เตรียมจากเหงือกของกุ้งกุลาดำที่ติด IHHNV สามารถทำให้กุ้งขาวติดไวรัสได้ในห้องปฏิบัติการ โดยสังเกตได้จากการที่มีการเพิ่มปริมาณของ IHHNV ซึ่งตรวจสอบได้จากการเพิ่มจำนวนของดีเอ็นเอของไวรัสด้วยวิธีพีซีอาร์จากนั้นได้สร้างอาร์เอ็นเสายคู่สองชนิดในแบคทีเรีย Escherichia coli สายพันธุ์ HT115 ที่จำเพาะต่อบริเวณที่ทับซ้อนกันระหว่าง ORF1 และ ORF2 (ORF1-2 dsRNA) และบริเวณ ORF3 (ORF3 dsRNA) โดยสร้างในรูปของอาร์เอ็นเอตั้งต้นที่มีลักษณะเป็น stem-loop จากการทดสอบความสามารถในการยับยั้ง IHHNV ในกุ้งขาว พบว่า ORF1-2 dsRNA และ ORF3 dsRNA สามารถยับยั้ง IHHNV ได้เป็นเวลาอย่างน้อย 8 วันในกุ้งที่ได้รับอาร์เอ็นเอสายคู่ก่อนการฉีดด้วย IHHNV เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ซึ่งการยับยั้งที่เกิดขึ้นเป็นผลจากการยับยั้งทั้งแบบจำเพาะและไม่จำเพาะ แต่การยับยั้งแบบไม่จำเพาะจะเห็นผลเฉพาะในช่วงแรกของการติดไวรัส ดังจะเห็นได้จากอาร์เอ็นเอสายคู่ที่ไม่มีความจำเพาะต่อยีนของ IHHNV (GFP dsRNA) ที่สามารถเห็นผลการยับยั้ง IHHNV ได้ในวันที่ 5 แต่จะมีการจำลองตัวของ IHHNV ได้มากขึ้นในวันต่อมา นอกจากนี้ ORF1-2 dsRNA ที่จำเพาะต่อยีนที่สร้างโปรตีนที่ไม่ใช่โปรตีนโครงสร้างสามารถยับยั้ง IHHNV ได้ดีกว่า ORF3 dsRNA ที่จำเพาะต่อยีนที่สร้างโปรตีนโครงสร้าง ผลจากการรักษากุ้งที่ติด IHHNV ด้วยอาร์เอ็นเอสายคู่พบว่าสามารถยับยั้งการจำลองตัวของ IHHNV ได้ดีเป็นเวลาอย่างน้อย 5 วันในกุ้งที่ได้รับ ORF1-2 dsRNA ภายใน 24 ชั่วโมงหลังจากทำให้ติดไวรัสโดยการฉีดด้วย IHHNV แต่กุ้งที่ได้รับอาร์เอ็นเอสายคู่ที่เวลา 48 ชั่วโมงหลังจากฉีดด้วย IHHNV จะมีการจำลองตัวของ IHHNV กลับมาได้บางส่วนในวันที่ 5 ส่วนการรักษากุ้งที่ติด IHHNV ในธรรมชาติด้วยอาร์เอ็นเอสายคู่นั้นยังไม่เห็นผลที่ชัดเจน ซึ่งต้องอาศัยการทดลองเพื่อหาสภาวะที่สามารถใช้อาร์เอ็นเอสายคู่ในการรักษากุ้งที่ติด IHHNV ได้อย่างมีประสิทธิภาพต่อไป จึงนับว่าโครงการนี้ได้แสดงให้เห็นแนวทางที่ชัดเจนว่าสามารถประยุกต์การใช้อาร์เอ็นเอสายคู่ในการยับยั้งการจำลองตัวของ IHHNV เพื่อการป้องกันและรักษากุ้งที่ติดไวรัสได้ในอนาคต Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) or Penaeus styliostris densovirus (PstDNV) is one of major shrimp viruses that cause significant loss in shrimp production and market value. In Penaeus vannamei, IHHNV infection leads to growth retardation and deformed abdominal segment and rostrum which are collectively known as runt-deformity syndrome. A recent RNA interference (RNAi) technology via the use of double-stranded RNA (dsRNA) has been demonstrated to be effective in prevention of a number of viruses in shrimp. Thus, the objective of this project is to investigate the potency of dsRNA to inhibit IHHNV replication in both preventive and curative modes. The IHHNV stock was prepared from the gill tissues of naturally infected P. monodon. The virus in the IHHNV-infected gill homogenate was infectious and was able to replicate in the shrimp as shown by an increasing of IHHNV levels in the pleopod of the shrimp injected with the IHHNV-infected gill homogenate. Two types of IHHNV specific dsRNA were designed from the overlapping sequences between ORF1 and ORF2 (ORF1-2 dsRNA) and from the sequence of ORF3 (ORF3 dsRNA). The dsRNAs were successfully produced in RNase III deficient Escherichia coli strain HT115 as a stemloop RNA precursor. The potency of the two dsRNAs to inhibit IHHNV replication was investigated in P. vannamei. When injected into the shrimp at 12 h prior to IHHNV challenge, both ORF1-2 dsRNA and ORF3 dsRNA could inhibit IHHNV replication in the shrimp for at least 8 days after injection. This inhibition of IHHNV by ORF1-2 dsRNA and ORF3 dsRNA occurred mainly in a sequence-specific manner because a sequence-independent inhibition of IHHNV by unrelated GFP dsRNA on day 5 was overcome by the virus on later days. Moreover, the inhibition from dsRNA that targets non-structural genes (dsORF1-2) seemed to be more effective than that from dsRNA targeting structural gene (ORF3 dsRNA). The therapeutic inhibition of IHHNV by ORF1- 2 dsRNA was performed with laboratory infected shrimp. Injection of ORF1-2 dsRNA within 24 h after IHHNV challenge could effectively inhibit IHHNV for at least 5 days, whereas the DNA level of IHHNV was recovered to some extent on day 5 in shrimp that were injected with dsRNA at 48 h following IHHNV infection. The therapeutic effect was also investigated in naturally infected P. monodon. Although the result suggested some degree of IHHNV inhibition by dsRNA in the shrimp that were naturally infected with IHHNV, more experiments should be performed to optimize the condition by which dsRNA could effectively inhibit IHHNV in naturally infected shrimp. Our results clearly demonstrated that dsRNAs specific to IHHNA genes could be applied to the prevention of IHHNV infection as well as to cure IHHNV infected shrimp.