โ ป ร ตีน Cyt2Aa2 เ ป็น โ ป ร ตีน ที่ส ร้า ง ขึ้น จ า ก เ ชื้อ จุลิน ท รีย์Bacillus thuringiensis spp. darmstadiensis โปรตีนชนิดนี้มีโครงสร้างเป็นโดเมนเดี่ยวประกอบด้วยชั้นของเกลียวอัลฟาจำนวนสอง ชั้นแทรกตรงกลางด้วยชั้นของแผ่นเบต้า เมื่อโครงสร้างโมเลกุลผ่านการตัดย่อยอย่างจำเพาะด้วนเอ็นไซม์ โปรติเอสแล้ว สามารถออกฤทธิ์ในการฆ่าลูกน้ำของยุงลายและยุงรำคาญได้ดี โครงการวิจัยนี้มี วัตถุประสงค์เพื่อศึกษาเกี่ยวกับความรู้พื้นของขบวนการจัดตัวและคลายตัวของโครงสร้างโปรตีน Cyt2Aa2 ในสภาวะที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยสารเคมี รวมทั้งวิเคราะห์ถึงบทบาทของกรดอะมิโนในตำแหน่ง ต่างๆของโครงสร้างโมเลกุลว่ามีความสำคัญและสัมพันธ์อย่างไรกับกลไกการรักษาเสถียรภาพและการ ทำงานในระดับโมเลกุล ผลจากการศึกษาวิจัยในโครงการนี้ พบว่าขบวนการม้วนจัดตัวและขบวนการ คลายตัวเป็นขบวนการย้อนกลับซึ่งกันและกัน มีการเปลี่ยนแปลงสถานะของโครงสร้างระหว่างสภาวะ โครงสร้างปกติ (Native) โครงสร้างที่คลายตัวบางส่วน (Intermediate) และโครงสร้างที่คลายตัวสมบูรณ์ (Unfolded) สอดคล้องกับ Three-state model เมื่อวิเคราะห์Unfolding/ Refolding curve ที่ได้ พบว่าค่า พลังงานFree Energy ของการเปลี่ยนแปลงระหว่าง Native (N) และ Intermediate (I) มีค่าประมาณ 5-6 kcal/ mol และ ค่าพลังงานของการเปลี่ยนแปลงสถานะระหว่าง Intermediate (I) และ Unfolded (U) มี ค่าประมาณ 12-16 kcal/ mol ตามลำดับ และต้องการพลังงานกระตุ้น 20-25 กิโลแคลอรี่ต่อโมล ซึ่งใน การก้าวข้ามจุดเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง เกิดขึ้นผ่านโครงสร้างที่มีลักษณะจำเพาะ (intermediate) ที่มีการ จัดตัวของโครงสร้างตติยภูมิ (Tertiary structure) ต่างจากโครงสร้างNative แต่ยังคงอนุรักษ์ลักษณะ โครงสร้างทุติยภูมิ (Secondary structure)ไว้ สามารถระบุได้ว่าโครงสร้างดังกล่าวมีลักษณะเป็น Molten globule state ในการตรวจสอบถึงบทบาทของกรดอะมิโนที่ตำแหน่งต่างๆที่เกี่ยวข้องกับขบวนการจัดตัว ของและการทำงานของของโครงสร้างโมเลกุล ได้ทำการออกแบบและสร้างโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงชนิดกลาย พันธุ์ (mutant toxins) ขึ้นจำนวนหนึ่ง โดยมีการแทนที่หรือตัดกรดอะมิโนที่อยู่ในตำแหน่งต่างๆของ โครงสร้างโมเลกุลออก พบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ส่วนหนึ่งมีพฤติกรรมเปลี่ยนแปลงไปจากโปรตีนต้นแบบ ทั้งในส่วนของขบวนการคลายตัวในและค่าของพลังงานที่เกี่ยวข้อง โดยกรดอะมิโนที่อยู่ที่ปลายด้าน N- และ C-terminal มีบทบาทสำคัญต่อการผลิตและจัดโครงสร้างโปรตีน และในการวิเคราะห์ ค่า? ของ โปรตีนกลายพันธุ์ต่างๆ ชี้แนะว่ากรดอะมิโนในหลายตำแหน่ง โดยเฉพาะอย่างยิ่งในตำแหน่งที่อยู่บน เกลียว?Helix มีความเกี่ยวข้องกับกลไกของการคลายตัว ความรู้ความเข้าใจจากงานวิจัยนี้ จะช่วยให้ นักวิจัยได้ทราบถึงรายละเอียดและการปรับเปลี่ยนโครงสร้างสามมิติของโปรตีน ซึ่งจะเป็นแนวทางในการ เข้าใจกลไกในการทำงานของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงกลุ่ม Cyt2 ได้ต่อไป Cyt2Aa2 is a 29-kDa cytolytic toxin produced by Bacillus thuringiensis subsp.darmstadiensis. It has a larvicidal activity against Dipteran larvae. The toxin has a single domain of ?/? architecture comprising two outer layers of ?-helix hairpins wrapped around ?- sheet, and require proteolytic processing to become an active toxin. This research project aims to characterize the process of protein unfolding and refolding of Cyt2Aa2 using a guanidinium hydrochloride induced environment. We have successfully identified three conformational states of Cyt2Aa2 as native (N), intermediate (I) and unfolded (U) states. Unfolding and refolding of toxin in 0-6 M GuHCl were observed as the reversal process. The determined conformational free energies of native and intermediate states are approximately 5.8 and 14.8 kcal/mol, respectively. The transitional kinetics of the two states revealed activation energy around 20-25 kcal/mol. Further characterization of the intermediate state has identified a molten-globule like conformation. The stabilizing role of amino acid residues in various positions of toxin structure relating to toxin conformation and function was also explored. Site-directed mutagenesis was employed to generate various mutant toxins with amino acid substitutions and deletions. These mutant toxins were investigated by unfolding experiment and assayed for their biological activity. Our results has shown that the amino acid residues located on the N and C termini of Cyt2Aa2 play a critical role in the production of expressed mutant toxins. ? analysis of amino acid mutation on various secondary structure elements of Cyt2Aa2 suggested that the helical element of toxin may have a contributing role in the transition between the unfolded and native conformation. From these results, the conformational intermediate was proposed to be partially maintained as the native conformation with a rearrangement on helical structural elements. This revealed intermediate may involve in the detailed mechanism of cytolytic toxin function