ปัญหาและสาเหตุของงานวิจัย การแพ้กุ้งในอาหารเป็นสาเหตุหนึ่งของการแพ้อาหารที่พบได้มาก จากการศึกษาการแพ้กุ้งในอาหารในเด็กไทย พบว่า ประเภทของกุ้งในอาหารที่แพ้มากที่สุด คือ กุ้งทะเล (seawater shrimps) กุ้งกุลาดำ (Penaeus monodon) และกุ้งน้ำจืด (freshwater shrimps) กุ้งก้ามกราม (Macrobrachium rosenbergii) ซึ่งเป็นกุ้งที่นำมาเป็นอาหารที่นิยมบริโภคมากในประเทศไทย จากผลของการทดสอบทางผิวหนัง (Skin prick test) และการให้รับประทานกุ้ง (food challenge) ของผู้ป่วยที่มีประวัติแพ้กุ้ง สามารถแบ่งกลุ่มของผู้ป่วยที่แพ้กุ้ง ได้ 3 กลุ่มดังนี้ 1) ผู้ป่วยที่แพ้กุ้งกุลาดำอย่างเดียว 2) ผู้ป่วยที่แพ้กุ้งก้ามกรามอย่างเดียว 3) ผู้ป่วยที่แพ้กุ้งกุลาดำ และกุ้งก้ามกราม เนื่องจากกุ้งกุลาดำ และกุ้งก้ามกรามเป็นกุ้งที่นิยมบริโภคมากในประเทศไทย และมีการส่งออกไปขายต่างประเทศในปริมาณมาก ดังนั้น โครงการนี้มีวัตถุประสงค์ที่ต้องการ ศึกษาวิจัยหาสารก่อภูมิแพ้จากกุ้งกุลาดำและกุ้งก้ามกรามที่เป็นสาเหตุใหญ่ของการแพ้กุ้งในอาหารในคนไทย และสังเคราะห์ cDNA และการผลิตสารก่อภูมิแพ้เพื่อนำไปพัฒนาเป็นชุดตรวจการแพ้กุ้งในอาหาร วิธีการวิจัย สารโปรตีนในเนื้อจากกุ้งกุลาดำ และจากกุ้งก้ามกรามถูกนำไปสกัดใน buffer จากนั้นนำน้ำยาสกัดที่ได้ไปใช้ในการวิเคราะห์หาสารก่อภูมิแพ้ที่จำเพาะต่อคนไทยโดยวิธี immunoblotting ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งทั้ง 3 กลุ่ม สำหรับการวิเคราะห์สารก่อภูมิแพ้ของกุ้งกุลาดำ สารก่อภูมิแพ้ที่มีขนาดน้ำหนักโมเลกุลเล็ก ทำโดยแยกสารโปรตีนสกัดจากกุ้งโดย SDS-PAGE และ 2 Dimentional gel electrophoresis และวิเคราะห์หาสารก่อภูมิแพ้ที่จำเพาะโดย immunoblotting ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งกุลาดำอย่างเดียว จากนั้นโดยอ้างอิงผลของ 2 D-PAGE/ immunoblotting เนื้อ gel ที่ positive spots ถูกตัดและนำไปวิเคราะห์โดยวิธี Peptide Mass Fingerprint (PMFP) ผ่านเครื่อง MALDITOF ส่วนสารก่อภูมิแพ้ที่มีขนาดน้ำหนักโมเลกุลใหญ่ ทำโดยแยกสารโปรตีนสกัดจากกุ้งโดยใช้ anion exchange column ที่แยกสารโปรตีนด้วยคุณสมบัติของประจุรวมของโปรตีน จากนั้นนำ bufferที่มีสารโปรตีนสกัดที่มีประจุรวมเหมือนกันมาวิเคราะห์โดย SDS-PAGE gel electrophoresis เพื่อแยกสารโปรตีนก่อนที่จะวิเคราะห์หาสารก่อภูมิแพ้ที่จำเพาะโดย immunoblotting จากนั้นโดยอ้างอิงผลของ SDS-PAGE/ immunoblotting ตัดเนื้อ gel ที่ positive spots เพื่อทำวิเคราะห์โดยวิธี Peptide Mass Fingerprint (PMFP) ผ่านเครื่อง MALDITOF สังเคราะห์ cDNA ของโปรตีนที่มีขนาดน้ำหนักโมเลกุลเล็ก (20 kDa) ที่ได้จากการวิเคราะห์โดยวิธี Peptide Mass Fingerprint โดยใช้วิธี RT-PCR นำ cDNA ที่ได้ไปเชื่อมต่อกับดีเอ็นเอพาหะของยีสต์ (pPICzA) และตรวจสอบความถูกต้องของยีนโดยการตรวจสอบลำดับเบสของดีเอ็นเอ นำดีเอ็นเอพาหะ (pPICzA) ที่มี cDNA ไป transform เข้าไปในเซลล์ยีสต์ Pichia pastoris (KM71) แล้วตรวจสอบการแลกเปลี่ยนของยีนที่กำหนดการสร้างรีคอมบิแนนท์โปรตีน กับยีนเดิมของยีสต์เซลล์ (integration screening) ก่อนที่จะเร่งให้มีการสร้างรีคอมบิแนนท์โปรตีน โดยใช้เมธานอล ทดสอบว่าเป็นสารก่อภูมิแพ้โดย immunoblotting ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งกุลาดำอย่างเดียว สำหรับการวิเคราะห์หาสารก่อภูมิแพ้จากกุ้งก้ามกราม ทำโดยแยกสารโปรตีนสกัดจากกุ้งโดยใช้ anion exchange column ที่แยกสารโปรตีนด้วยคุณสมบัติของประจุรวมของโปรตีน จากนั้นนำ buffer ที่มีสารโปรตีนสกัดที่มีประจุรวมเหมือนกันมาวิเคราะห์โดย SDS-PAGE gel electrophoresis เพื่อแยกสารโปรตีนก่อนที่จะวิเคราะห์หาสารก่อภูมิแพ้ที่จำเพาะโดย immunoblotting ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งก้ามกรามอย่างเดียว จากนั้น โดยอ้างอิงผลของ SDS-PAGE/ immunoblotting ตัดเนื้อ gel ที่ positive spots เพื่อทำวิเคราะห์โดยวิธี LC-MS/MS โดยอ้างอิงผลวิเคราะห์ของ LC-MS/MS ทำการแยกโปรตีนจากน้ำยาสกัดจากกุ้งโดยใช้ anion exchange column และ size exclusion column ทดสอบโปรตีนที่แยกได้ว่าเป็นสารก่อภูมิแพ้โดย immunoblotting และ inhibition ELISA ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งก้ามกรามอย่างเดียว ผลการวิจัย ผลการวิเคราะห์หาสารก่อภูมิแพ้ที่จำเพาะต่อคนไทยโดยวิธี immunoblotting ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้ง ทั้ง 3 กลุ่ม รวมจำนวนทั้งหมด 61 คน พบว่า กลุ่มของผู้ป่วยที่แพ้กุ้งมีสารก่อภูมิแพ้ที่จำเพาะในกลุ่มของตนและ ระหว่างกลุ่มมีสารก่อภูมิแพ้ที่จำเพาะแตกต่างกัน จะมีเพียงหนึ่งถึงสามสารที่อาจจะเป็นสารก่อภูมิแพ้ชนิดเดียวกัน cross-reactive allergen สำหรับการวิเคราะห์หาสารก่อภูมิแพ้จากกุ้งก้ามกราม ผลวิเคราะห์ของ LC-MS/MS ได้แสดงว่า โปรตีนฮีโมไซยานิน มีขนาดน้ำหนักโมเลกุล 75 kDa เป็นสารก่อภูมิแพ้ ผลการทดสอบโปรตีนฮีโมไซยานินที่แยกจากการสกัดจากกุ้งโดยใช้ anion exchange column และ size exclusion column โดย immunoblotting และ inhibition ELISA ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งก้ามกรามอย่างเดียว แสดงการจับแบบจำเพาะกับแอนติบอดี IgE ด้วยค่าปฏิสัมพันธ์สูง สำหรับการวิเคราะห์สารก่อภูมิแพ้ของกุ้งกุลาดำ ผลการวิเคราะห์โดยวิธี Peptide Mass Fingerprint (PMFP) แสดงว่าโปรตีน lipid binding protein (LBP) ขนาดน้ำหนักโมเลกุล 20 kDa และโปรตีน alpha actinin ขนาดน้ำหนักโมเลกุล 106 kDa เป็นสารก่อภูมิแพ้ของกุ้งกุลาดำ ผลการวิเคราะห์โดย immunoblotting ใช้ แอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งกุลาดำอย่างเดียว พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน LBP และโปรตีน alpha actinin ที่สกัดโดยใช้ anion exchange column และตัดจาก SDS-PAGE gel electrophoresis มีการจับกับแอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยที่แพ้กุ้งกุลาดำอย่างเดียวด้วยค่าปฏิสัมพันธ์ที่ต่ำมาก การพัฒนาชุดตรวจการแพ้กุ้งในอาหารโดยใช้น้ำยาสกัดจากกุ้ง พบว่า ชุดตรวจการแพ้กุ้งในอาหารสามารถเก็บรักษาได้เป็นเวลา 1 เดือนโดยเก็บที่อุณหภูมิ -20oC ที่สถานะนี้ สารก่อภูมิแพ้ของกุ้ง ยังสามารถคงอยู่ในลักษณะโปรตีน ผลสรุปของโครงการ การวิเคราะห์สารก่อภูมิแพ้ของกุ้งก้ามกราม โปรตีนฮีโมไซยานิน มีขนาดน้ำหนักโมเลกุล 75 kDa จากกุ้งก้ามกราม เป็นสารก่อภูมิแพ้ต่อผู้ป่วยที่แพ้กุ้งก้ามกรามอย่างเดียว ส่วนการวิเคราะห์สารก่อภูมิแพ้ของกุ้งกุลาดำ พบแต่สารที่จับกับแอนติบอดี IgE จากผู้ป่วยด้วยค่าปฏิสัมพันธ์ที่ต่ำมาก น้ำยาสกัดจากกุ้งสามารถนำไปใช้ตรวจการแพ้กุ้งในอาหาร โดยวิธี Skin Prick Test ได้ และสามารถเก็บรักษาได้เป็นเวลา 1 เดือน ที่อุณหภูมิ -20oC Background Seawater shrimp, Penaeus monodon (กุ้งกุลาดำ, P. monodon), and giant freshwater shrimp, Macrobrachium rosenbergii (กุ้งก้ามกราม, M. rosenbergii), are one of the common cause of food hypersensitivity reactions among children shrimp-allergic patients in Thailand. Interestingly, three groups of shrimp-allergic patients are classified, 1) allergic to only giant freshwater shrimp, M. rosenbergii, 2) allergic to only seawater shrimps, P. monodon), and 3) allergic to both M. rosenbergii and P. monodon. Since these two species of shrimp are the favorite consumed shrimps in Thailand as well as are exported worldwide, thus, this project aimed to identify major allergens from P. monodon and M. rosenbergii for Thai populations and to clone and express recombinant novel shrimp allergens for developing as diagnostic reagents. Methods Crude extracts from two species of shrimp Pm and Mb were prepared. Profile of specific IgE-shrimp allergens of patients based on their clinical diagnosis was identified by immunoblotting using serum specific IgE. For Pm allergens, low MW (LMW) IgE bound proteins in crude extracts were separated by 2D-gel electrophoresis and detected by immunoblotting. 2D-SDS gel pieces were excised from spots matching specific IgE-protein spot were analyzed by MS peptide fingerprinting. For high MW (HMW) IgE bound proteins in crude extracts were fractionated by anion exchange column. High MW IgE bound proteins were identified from eluate fractions by immunoblotting. SDS gel pieces were excised and analyzed by MS peptide fingerprinting. RT-PCR to amplify cDNA encoding lipid binding protein for Pm LMW allergen was amplified and ligated with vector for protein expression in yeast. Immunoblot using serum specific IgE was performed. For novel Mr allergen was identified in fractionated proteins from anion chromatography using serum IgE. IgE bound proteins were analyzed by LC/MS/MS. Novel allergen was purified from shrimp Mr extract through anion and size exclusion chromatography. Immunoblotting and inhibition ELISA were performed to confirm allergenicity. Results Based on Skin Prick Test and Oral challenge, three groups in a total of 61 patients, allergic to only P. monodon shrimp (Pm), allergic to only M. rosenbergii (Mr), and allergic to both shrimp species (PmMr) were identified. Specific IgE-shrimp allergens profiles of all shrimp-allergic patients from three groups were different among each group. One IgE bound protein from shrimp Mr was selected and analyzed by LC-MS/MS. Identified protein was 75 kDa monomeric subunit of hemocyanin (Hcs). Further results of immunoblotting and inhibition ELISA confirmed that the Mr Hcs had IgE reactivity. Moreover, the Mr Hcs did not have non-cross reactivity with IgE from patients that were allergic to only seawater shrimps, P. monodon. For Pm IgE bound proteins, results of MS peptide fingerprinting analysis identified 20 kDa lipid binding protein (LBP) and 106 kDa alpha actinin. The LBP was cloned while the 106 kDa actinin was partially purified. However, results of immunoblotting showed both proteins had a very weak IgE reactivity. A diagnostic reagent for Skin Prick Test to test shrimp-allergic reactions was also developed. Results of immunoblotting showed most allergens were preserved after 4 weeks stored at-20oC storage condition. On the contrary, at 4oC storage condition, few allergens were remained after 2 weeks. Boiled-shrimp extracts stored at 4oC and -20oC had stronger signal of IgE-allergens complex than raw-shrimp extracts. Moreover, in both raw and boiled shrimp extracts, the IgE bound 36-40 kDa allergens could be accounted as major allergens since they were observed in all IgE –allergen profiles. Conclusions The novel major allergen of shrimp Mr was identified as 75 kDa monomeric subunit of hemocyanin. As for allergens of shrimp Pm, two purified proteins were not allergens due to a very weak IgE reactivity. Solution of shrimp extracts was developed as a diagnostic reagent for Skin Prick Test. The solution could be used and stored at -20oC for 4 weeks without losing allergen contents.