เอนไซม์ไคติเนส เอ จากเชื้อแบคทีเรียในทะเล Vibrio harveyi เป็นเอนไซม์ที่สลายไคตินให้เป็น น้ำตาลไคโตโอลิโกแซคคาร์ไรด์และไคโตไบโอสเป็นผลิตผลหลัก งานวิจัยก่อนหน้าได้ทำการโคลนยีนไค ติเนส เอ และได้ศึกษาคุณสมบัติทางเอนไซม์ไคติเนส เอ งานวิจัยนี้อธิบายบทบาทของกรดอะมิโนวงแหวนที่ บริเวณจับกับสับสเตรทและกรดอะมิโนที่ผิวของเอนไซม์ในการสลายสับสเตรทไคตินและไคโตโอลิโกแซค คาร์ไรด์โดยทำการเปลี่ยนกรดอะมิโน Trp70 Trp168 Tyr171 Trp231 Tyr245 Trp275 Trp397 และ Trp570 การทดสอบหาค่า specific hydrolyzing activity ของไคติเนสกลายพันธุ ์ พบว่ามีเอนไซม์กลาย พันธุ์ตัวเดียวคือ W397F ที่ให้ค่าแอคติวิตี้สูงกว่าเอนไซม์ดั้งเดิมส่วนเอนไซม์กลายพันธุ์อื่นมีค่าแอคติวิตี้ ลดลงอย่างมาก การวิเคราะห์หาน้ำตาลผลิตผลที่สร้างขึ้นโดยวิธี TLC พบว่าเมื่อกรดอะมิโนที่ตำแหน่งรีดิวซ์ Trp275 ถูกเปลี่ยนเป็น Gly และ Trp397 เปลี่ยนเป็น Phe ทำให้รูปแบบการสลายน้ำตาลสายสั้นเปลี่ยนไป อย่างสิ้นเชิงแสดงว่ากรดอะมิโนทั้งสองน่าจะมีความสำคัญต่อการเลือกจับของน้ำตาลไคโตโอลิโกแซคคาร์ ไรด์ การศึกษาการจับกับไคตินและการทดลองทางจลนพลศาสตร์แสดงให้เห็นว่า Trp70 ซึ่งพบอยู่ที่ผิวที่ ปลายด้านเอ็นของโดเมนจับไคตินมีความสำคัญมากต่อการจับกับไคตินสายยาว การตรวจหารูปแบบการ จับของสับสเตรทโดยเทคนิค HPLC MS พบว่า NAG6 ชอบบริเวณจับ -2 ถึง + 2 มากกว่าบริเวณจับ -3 ถึง +2 ส่วน NAG5 จะจับกับบริเวณจับ -2 ถึง +2 อย่างเดียวในขณะที่ crystalline ? chitin จะเริ่มจับที่บริเวณ จับได้หลายตำแหน่งทำให้สลายตัวกลางไคโตโอลิโกแซคคาร์ไรด์ได้หลายชนิดซึ่งตัวกลางเหล่านี้จะจับกับ ตำแหน่ง -2 ถึง +2 เป็นหลัก นอกจากนี้ยังพบว่าไคติเนสกลายพันธุ์ W275G และ W397F มีความชอบต่อ สับสเตรทชนิด ? มากกว่าสับสเตรทชนิด ? การศึกษาโครงสร้างผลึกของเอนไซม์ไคติเนสดั้งเดิมและ เอนไซม์กลายพันธุ์ที่ไม่เร่งปฏิกิริยา E315M ในสภาวะที่ไม่มีและมีสับสเตรทให้ความละเอียดของโครงสร้าง สูงในช่วง 2.0 – 1.7 อังสตรอม โครงสร้างโดยรวมของเอนไซม์ไคติเนสประกอบด้วย 3 โดเมนแยกกันคือ i) โดเมนจับไคตินที่ปลายด้านเอ็น ii) โดเมนเร่งปฏิกิริยา (?/?)8 TIM-barrel และ iii) โดเมนแทรกขนาดเล็ก (?+?) บริเวณเร่งของเอนไซม์มีลักษณะเป็นร่องยาวลึกประกอบด้วยบริเวณจับหกบริเวณคือ (-4)(-3)(-2)(- 1)(+1)(+2) โครงสร้างเชิงซ้อนของ E315M กับไคโตโอลิโกแซคคาร์ไรด์แสดงโครงรูปตรงของน้ำตาล NAG5 แต่โครงรูปงอของน้ำตาล NAG6 ข้อมูลโครงสร้างที่ได้ให้หลักฐานว่าน้ำตาลที่จับอยู่มีการเปลี่ยนโครงรูปก่อน ถูกสลายซึ่งน่าจะเกิดผ่าน ‘slide-and- bend’ mechanism Chitinase A from a marine bacterium Vibrio harveyi is an enzyme that degrades chitin to chitooligosaccharides, yielding chitobioase as the major product. The gene encodes chitinase A was previously cloned and its enzymatic properties characterized. This study describes the functional roles of the aromatic residues located at the substrate binding cleft and the surfaceexposed residues in chitin and chitooligosaccharide hydrolyses. Point mutations of Trp70, Trp168, Tyr171, Trp231, Tyr245, Trp275, Trp397, and Trp570, were generated. Investigation of specific hydrolyzing activity indicated that only mutant W397F had enhanced activity, while other mutants showed a significant loss of the activity. TLC analysis of product formation showed a complete change in the hydrolytic patterns of short-chain substrates when the reducing end residues Trp275 was mutated Gly and Trp397 to Phe, suggesting that both residues were crucial for the binding selectivity of chitinoligosaccharides. Chitin binding assay and kinetic experiments suggested that Trp70, which is located on the surface at the N-terminal end of the chitin binding domain, was the essential binding residue for a long-chain chitin. Assessment of substrate binding modes by HPLC MS revealed that NAG6 preferred subsites -2 to + 2 over subsites -3 to +2 and NAG5 only bound to subsites -2 to +2. Crystalline ? chitin initially occupied various subsites, generating variuos chitioligosaccharide intermediates which later interacted mainly to subsites -2 to +2. In addition, mutants W275G and W397F preferred ? substrates over ? substrates. Four crystal structures of chitinase A and its catalytically inactive mutant (E315M) were solved in the absence e and presenc of substrates to high resolutions of 2.0 – 1.7 ?. The overall structure of chitinase A comprises three distinct domains: i) the N-terminal chitin-binding domain; ii) the main catalytic (?/?)8 TIM-barrel domain; and iii) the small (?+?) insertion domain. The catalytic cleft of chitinase A has a long, deep groove, which contains six binding subsites (- 4)(-3)(-2)(-1)(+1)(+2). Structures of E315M-chitooligosaccharide complexes display a linear conformation of NAG5, but a bent conformation of NAG6. The crystallographic data provides evidence that the interacting sugars undergo conformational changes prior to hydrolysis most likely via the ‘slide-and-bend’ mechanism.