งานวิจัยนี้เป็นพัฒนาวิธีการ Immobilized เอนไซม์ pfDHFR บน solid support เพื่อใช้ ในการคัดเลือกสารที่คุณสมบัติที่ดีในการจับเอนไซม์ pfDHFR จาก Combinatorial library โดย ได้ทำการเตรียมเอนไซม์ pfDHFR ที่มีกรดอะมิโน cysteine ที่ปลาย C-terminal เพี่อนำไปตรึง บนเจล thiopropyl-Sepharose โดยเชื่อมด้วยพันธะ S-S ปริมาณของเอนไซม์ที่ติดบนเจลวัด ได้ประมาณ 4-5 มิลลิกรัมต่อเจลแห้ง 1 กรัม โดย activity ของเอนไซม์ที่ติดบนเจล (immobilized enzyme) มีค่าใกล้เคียงกับเอนไซม์อิสระหลังจากที่ตัดออกจากเจลแล้ว นำ immobilized เอนไซม์ที่เตรียมได้นี้ไปใช้ในการคัดเลือกตัวยับยั้งที่ดีออกจากห้องสมุดเชิงรวม โดยอาศัยความสามารถที่แตกต่างกันในการจับตัวของเอนไซม์กับตัวยับยั้งแต่ละตัว เมื่อ วิเคราะห์หาชนิดและปริมาณของตัวยับยั้งที่ไม่ถูกเอนไซม์จับด้วยเครื่อง HPLC-MS ก็จะรู้ว่าตัว ยับยั้งตัวใดที่มีความสามารถจับกับเอนไซม์ได้ดี โดยสามารถยืนยันได้จากผลการวิเคราะห์ตัว ยับยั้งที่ถูกเอนไซม์จับไว้ ซึ่งจะถูกทำให้หลุดออกจากเอนไซม์โดยกัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์ (guanidine hydrochloride) In this study, the method for immobilization of pfDHFRs onto the solid support has been developed for the selection of tight-binding inihibitors from combinatorial library. pfDHFRs with cysteine residue at the C-terminal have been prepared in order to immobilize to a thiopropyl-Sepharose gel via S-S linkage. The amount of immobilized DHFRs was estimated to be 4-5 mg/g of dried gel, and the activities of the bound DHFRs were comparable to that of the free enzymes. The prepared immobilized enzyme has been used for the selection of tight-binding inhibitors from the combinatorial library, based on the affinities of each inhibitor with the enzyme. Free inhibitors were then identified and analyzed quantitatively by high performance liquid chromatographymass spectrometry (LC-MS) and the components with high binding affinity of the library could thus be realized. Results could be confirmed by quantitative analysis of the bound inhibitors released from the enzyme by guanidine hydrochloride treatment.