10.3 วิธีการทดลอง

10.3.1 การเตรียมเชื้อเริ่มต้นและเลี้ยงเชื้อ L. komagatae 183

นำเชื้อ L. komagatae 183 ที่เก็บรักษาใน NB ผสมกลีเซอรอลร้อยละ 25 ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส มาเขี่ยบนอาหาร NA บ่ม 24 ชั่วโมง นำโคโลนีเดี่ยวของแบคทีเรียที่ได้เติมลงในอาหาร NB ปริมาตร 5 มิลลิลิตรในหลอดทดลองขนาด 12 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิห้อง บนเครื่องเขย่าความเร็ว 200 รอบต่อนาที เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อเป็นเชื้อเริ่มต้น

ถ่ายเชื้อเริ่มต้นที่มีค่า OD₆₀₀ เท่ากับ 0.5 ปริมาตร 2.0 มิลลิลิตร ลงในหลอดที่มีอาหาร MSM ปริมาตร 100 มิลลิลิตร เติมน้ำตาลทราย และโมโนโซเดียมกลูตาเมตเป็นแหล่งคาร์บอนและไนโตรเจน ร้อยละ 1 (w/v) ตามลำดับ ปรับค่าพีเอชอาหารเท่ากับ 7.0 เลี้ยงเชื้อที่อุณหภูมิห้อง เขย่าบนเครื่องเขย่าที่ความเร็ว 150 รอบต่อนาที เป็นเวลา 3-5 วัน เก็บตัวอย่างทุกๆ 6 ชั่วโมง วัดการเจริญของเชื้อ ค่าพีเอช ปริมาณของสารลดแรงตึงผิวชีวภาพ และกิจกรรมของสารลดแรงตึงผิวชีวภาพ (การลดแรงตึงผิวและการเกิดอิมัลชั่น)

เมื่อทราบลักษณะการเจริญ และการผลิตสารลดแรงตึงผิวชีวภาพแล้ว จึงเลี้ยงเชื้อตามขั้นตอนข้างต้น เพื่อเก็บตัวอย่างในช่วงเวลาที่มีกิจกรรมของสารลดแรงตึงผิวชีวภาพสำหรับการทดลองขั้นตอนต่อไป 

10.3.2 การสกัดสารลดแรงตึงผิวชีวภาพจากเชื้อ L. komagatae 183

นำน้ำหมักจากการเลี้ยงเชื้อ L. komagatae 183 มาปั่นเหวี่ยงแยกเซลล์ที่ความเร็ว 8,500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที นำสารละลายส่วนใสที่ได้ปริมาตร 50 มิลลิลิตร มาสกัดสารลดแรงตึงผิวชีวภาพด้วยตัวทำละลายอินทรีย์ (ชวิกานต์ แจ่มจันทร์ และชุติพร ยังหลัง, 2555) ดังนี้

นำสารละลายส่วนใสมาสกัดด้วยตัวทำละลายผสมระหว่างคลอโรฟอร์มกับเอทานอล (2:1) ในอัตราส่วนสารละลายส่วนใสต่อตัวทำละลายอินทรีย์ 1:1 สกัดซ้ำ 2 ครั้ง ระเหยตัวทำละลายอินทรีย์ด้วยเครื่องระเหยแบบสุญญากาศ นำตะกอนไปอบที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วนำมาชั่งน้ำหนัก เพื่อหาปริมาณของสารลดแรงตึงผิวชีวภาพ (น้ำหนักแห้ง) ละลายตะกอนร้อยละ 1 (น้ำหนักต่อปริมาตร) กลับกับในน้ำกลั่นแล้วหาความเข้มข้นที่น้อยที่สุดที่ทำให้เกิดกิจกรรมสารลดแรงตึงผิว (Critical micelle concentration) และกิจกรรมของสารลดแรงตึงผิวชีวภาพ

10.3.3 การหาจุดวิกฤตของการเกิดไมเซลล์ (Critical micelle concentration, CMC)

CMC หรือ Critical micelle concentration เป็นระดับความเข้มข้นที่ต่ำสุดของสารลดแรงตึงผิวที่ทำให้เกิดไมเซลล์ สามารถหาได้จากการนำสารลดแรงตึงผิวชีวภาพจากเชื้อ L. komagatae 183 ที่สกัดได้ หรือสารลดแรงตึงผิวอื่นๆ มาชั่งน้ำหนัก และละลายในน้ำกลั่นปริมาตร 15 มิลลิลิตร คำนวณหาความเข้มข้นของสารละลายของสารลดแรงตึงผิวชีวภาพ ทำการเจือจางสารละลายของสารลดแรงตึงผิวด้วยน้ำกลั่นแบบ two fold dilution ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆ นำไปวัดค่าแรงตึงผิวด้วยเครื่องวัดค่าแรงตึงผิว นำค่าที่ได้ไปเขียนกราฟระหว่างค่าแรงตึงผิวกับระดับความเข้มข้นของสารลดแรงตึงผิวต่างๆ เพื่อหาค่า CMC ของสารลดแรงตึงผิวนั้น

10.3.4 ศึกษาประสิทธิภาพในการเกิดอิมัลซิฟิเคชั่นของสารลดแรงตึงผิวกับน้ำมันไบโอดีเซล

นำสารละลายของสารลดแรงตึงผิวชีวภาพที่ระดับความเข้มข้น 1xCMC ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ผสมกับน้ำมันไบโอดีเซล ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ในหลอดทดลอง ผสมให้เข้ากันด้วยการเขย่าความเร็วรอบสูงสุดเป็นเวลา 2 นาที ตั้งทิ้งไว้ 1 นาที 10 นาที 60 นาที 24 ชั่วโมง และ 48 ชั่วโมง วัดประสิทธิภาพของการเกิดกิจกรรมอิมัลชั่น โดยวัดส่วนสูงของสารละลายทั้งหมดและส่วนสูงของอิมัลชั่นที่เกิดขึ้น

10.3.5 การย่อยสลายน้ำมันไบโอดีเซลโดยใช้สารลดแรงตึงผิวชีวภาพจากเชื้อ L. komagatae

         183 และกลุ่มเชื้อจุลินทรีย์ท้องถิ่น

เตรียมกลุ่มเชื้อจุลินทรีย์ท้องถิ่นด้วยการนำตัวอย่างดินจากบริเวณที่มีการปนเปื้อนน้ำมันไบโอดีเซลปริมาณ 10 กรัม ใส่ในอาหาร MSM ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ที่มีการเติมน้ำมันไบโอดีเซลร้อยละ 1 (w/v) เป็นแหล่งคาร์บอนแทนที่น้ำตาลทราย บ่มที่อุณหภูมิห้อง บนเครื่องเขย่าความเร็ว 150 รอบต่อนาที เมื่อสังเกตเห็นการเจริญของเชื้อ (อาหารเลี้ยงเชื้อมีความขุ่นเมื่อเทียบชุดควบคุมที่ไม่มีการเติมตัวอย่างดิน) ทำการถ่ายเชื้อจำนวน 3 รอบ ในอาหารเลี้ยงเชื้อและเลี้ยงเชื้อตามสภาวะข้างต้น เขี่ยเชื้อลงบนอาหารแข็ง MSM ที่มีการเติมน้ำมันไบโอดีเซลร้อยละ 1 (w/v)  เพื่อดูลักษณะของเชื้อที่ได้ และทำการเก็บรักษาใน NB ผสมกลีเซอรอลร้อยละ 25 ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ใช้เชื้อที่คัดแยกได้เป็นเชื้อเริ่มต้นในการศึกษาต่อไป  

ในการศึกษาการย่อยสลายน้ำมันไบโอดีเซล เตรียมอาหาร MSM ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ที่มีการเติมน้ำมันไบโอดีเซลร้อยละ 1 (w/v) และทำการทดลองดังนี้

ชุดที่ 1 - อาหารเลี้ยงเชื้อ MSM + น้ำมันไบโอดีเซล (ชุดควบคุม)
ชุดที่ 2 - อาหารเลี้ยงเชื้อ MSM + น้ำมันไบโอดีเซล + สารลดแรงตึงผิว
ชุดที่ 3 - อาหารเลี้ยงเชื้อ MSM + น้ำมันไบโอดีเซล + กลุ่มเชื้อจุลินทรีย์

ชุดที่ 4 - อาหารเลี้ยงเชื้อ MSM + น้ำมันไบโอดีเซล + สารลดแรงตึงผิว + กลุ่มเชื้อจุลินทรีย์

ชุดที่ 5 - อาหารเลี้ยงเชื้อ MSM + น้ำมันไบโอดีเซล + เชื้อ L. komagatae 183

ชุดที่ 6 - อาหารเลี้ยงเชื้อ MSM + น้ำมันไบโอดีเซล + เชื้อ L. komagatae 183 + กลุ่มเชื้อจุลินทรีย์

หมายเหตุ : ใช้สารลดแรงตึงผิวชีวภาพที่ 1xCMC; ปริมาณเชื้อเริ่มต้นที่ใช้ร้อยละ 5 (v/v)

บรรณานุกรม