วิธีการดำเนินการวิจัย และสถานที่ทำการทดลอง/เก็บข้อมูล

14.1   แบคทีเรียที่ใช้ในการศึกษา

          แบคทีเรียในการศึกษานี้เป็น เชื้อ Lactobacillus จำนวน 10 ชนิดสายพันธุ์ ซึ่งได้มาจาก การศึกษาระยะยาวถึงความสัมพันธ์ของแบคทีเรียและโรคฟันผุในเด็กที่อำเภอ เทพา จังหวัดสงขลา (12) เป็น Lactobacillus จำนวนทั้งหมด 216 สายพันธุ์    มีเชื้อ L. fermentum 52 สายพันธุ์  L. paracasei 12 สายพันธุ์     L. casei 20 สายพันธุ์   L. rhamnosus 14 สายพันธุ์    L. salivarius 54 สายพันธุ์    L. plantarum 16  สายพันธุ์  L. oris 13   สายพันธุ์  L. mucosae  7  สายพันธุ์   L. gasseri  18   สายพันธุ์  และ L. vaginalis 10 สายพันธุ์  เชื้อเหล่านี้ถูก เก็บไว้ในอาหารเก็บเชื้อที่    -80°C จนกว่าจะใช้ในการศึกษา

14.2   ทดสอบการยึดเกาะและการเข้าสู่เซลล์เยื่อบุผิวของ Lactobacillus

เซลล์ที่ใช้ในการทดสอบ คือ เซลล์ Keratinocyte H 357 ซึ่งมาจากเซลล์มะเร็งเยื่อบุช่องปากของคน  (oral squamous cell carcinoma)   และเซลล์ไฟโบรบลาสต์ L929 ซึ่งมาจากเนื้อเยื่อยึดต่อปกติใต้ผิวหนังของหนู

                เซลล์ H 357 ถูกเลี้ยงด้วยอาหารสำหรับเคอราติโนไซต์ (keratinocyte growth medium; KGM) ประกอบด้วยอาหารหลัก 3 ต่อ 1 ของ DMEM และ Ham’s F-12   เสริมด้วย epidermal growth factor (10 ng/ml)  hydrocortisone (0.5 ug/ml) และ fetal bovine serum 10%   ทำการบ่มเซลล์ในตู้บ่มที่อุณหภูมิ 37°C  มีความชื้น และมีคาร์บอนไดออกไซด์ 5%  นำเซลล์ออกจากภาชนะเลี้ยงเมื่อเซลล์มีปริมาณ 80-90% ของภาชนะ

                เซลล์ L 929 ถูกเลี้ยงด้วยอาหารสำหรับไฟโบรบลาสต์ (fibroblast growth medium; FGM) ประกอบด้วย DMEM และ fetal bovine serum 10%  เสริมด้วยกลูตามีน (2 mM/L)  ทำการบ่มเซลล์ในตู้บ่มที่อุณหภูมิ 37°C  มีความชื้น และมีคาร์บอนไดออกไซด์ 5%  นำเซลล์ออกจากภาชนะเลี้ยงเมื่อเซลล์มีปริมาณ 80-90% ของภาชนะ

                ในการทดสอบเตรียมเซลล์ที่ใช้ทดสอบ (70,000 เซลล์/หลุม) ในหลุมเลี้ยงเซลล์ชนิด 24 หลุม ด้วยอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีซีรั่ม 10% เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ภายในตู้บ่มเซลล์ที่มีอุณหภูมิ 37°C และคาร์บอนไดออกไซด์ 5% จนกระทั่งได้เซลล์เจริญเต็มพื้นที่ก้นหลุม จากนั้นล้างเซลล์ในแต่ละหลุมด้วยสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS) 2 ครั้ง เติม Lactobacillus ที่ต้องการทดสอบ ซึ่ง ถูกเพาะเลี้ยงเลี้ยง 24 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37°C สภาวะ H₂ 10%, CO₂ 10% และ N₂ 80% และล้างด้วย PBS 3 ครั้ง ปรับให้มีความขุ่นที่ OD_600nm เท่ากับ 0.2 (~10⁸ cfu/ml) ด้วย DMEM และใส่ในเซลล์เพาะเลี้ยงแต่ละหลุม ๆ ละ 1 มล. เลี้ยงเซลล์และแบคทีเรียเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ภายในตู้บ่มเซลล์  จากนั้นล้างแบคทีเรียที่ไม่เกาะเซลล์ออกด้วย PBS 3 ครั้ง ก่อนทำการขูดเซลล์ใน PBS 1 มล.  ทำการ Serial dilution ด้วย PBS (1:10) แล้วทำการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียบน MRS agar นับจำนวนแบคทีเรียหลังบ่มเพาะ 48 ชั่วโมง     นอกจากนี้ทำการย้อมสีแกรมเพื่อดูเซลล์ที่ขูดออกมาว่ามีแบคทีเรียเกาะอยู่จริง

สำหรับการทดสอบการเข้าสู่เซลล์ (Invasion) ของแบคทีเรีย ทำเช่นเดียวกับที่กล่าวข้างต้น หากแต่ภายหลังเลี้ยงเซลล์ร่วมกับแบคทีเรียเป็นเวลา 1 ชม. และล้างเซลล์ด้วย PBS 3 ครั้ง   เติมยาปฏิชีวนะ gentamycin (100 ug/ml ใน DMEM) หลุมละ 1 มล.  บ่มเซลล์เป็นเวลา 2 ชม. เพื่อทำการฆ่าแบคทีเรียที่อยู่ภายนอกเซลล์  ทำการล้างด้วย PBS 3 ครั้ง จากนั้นทำการขูดเซลล์และเพาะเลี้ยงแบคทีเรียด้วยวิธีการที่กล่าวข้างต้น 

14.3   การทดสอบ hydrophobicity

                                การทดสอบความสามารถในการเกาะติดสาร hydrocarbon ของ Lactobacillus ตามวิธีของ Colloca และคณะ (11) สาร hydrocarbon ที่ใช้ในการทดสอบ ได้แก่ hexadecane xylene และ toluene ในการทดสอบ Lactobacillus แต่ละสายพันธุ์จะถูกปรับความขุ่นในน้ำเกลือที่ OD_600nm ให้ได้ความขุ่นระหว่าง 0.4-0.6 เติมสาร hydrocarbon ที่ต้องการทดสอบ เขย่าอย่างแรงให้ผสมกันเป็นเวลา 1 นาที ตั้งให้สารผสมทั้งสองชั้นแยกจากกัน ดูดส่วนล่างซึ่งเป็นชั้นของน้ำเกลือ มาวัดค่าความขุ่นอีกครั้งหนึ่ง คำนวณค่า % hydrophobicity (% hydrophobicity = OD_before-OD_after/OD_before ´ 100) Lactobacillus จะถูกจัดแบ่งเป็น 3 กลุ่มคือ low hydrophobicity (0-35%), moderate hydrophobicity (36-70%) และ high hydrophobicity (71-100%)

             14.4  การทดสอบ Surface charge

                                การทดสอบ Surface charge โดยศึกษาความเป็น basic และ acidic ของพื้นผิวของ Lactobacillus ทดสอบโดยการเกาะติด chloroform และ ethyl acetate ตามวิธีของ Pelletier และคณะ (13) เนื่องจาก chloroform มีคุณสมบัติเป็น Lewis acids จะสามารถจับกับสารที่ electron สำหรับ ethyl acetate มีคุณสมบัติเป็น basic จะสามารถจับกับสาร Lewis acids คำนวณค่า % surface charge ดังกล่าวในข้อ 13.3 Lactobacillus จะถูกจัดแบ่งเป็น 3 กลุ่มคือ low (0-35%), moderate (36-70%) และ high (71-100%)

14.5 หาความสัมพันธ์ของคุณสมบัติในข้อ 14.2 -14.4 และสภาวะฟันผุ

การศึกษาครั้งนี้เป็นการต่อยอดโครงการที่ได้มีรายงานการวิจัยและได้รับการตีพิมพ์มาแล้ว โดย Piwat และคณะ (2010) (14) ซึ่งทำการศึกษาเชื้อ Lactobacillus กับโรคฟันผุในเด็ก ดังนั้นจึงมีข้อมูลทางคลินิกเกี่ยวกับสถานะของโรคฟันผุ จึงสามารถที่จะนำเชื้อ Lactobacillus สายพันธุ์ที่ทำการคัดเลือกได้ในวัตถุประสงค์ข้อที่ 1  และ 2 มาหาความสัมพันธ์ในวัตถุประสงค์ข้อที่ 3 ได้