งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ที่จะสร้าง full length infectious RNA transcript ของไวรัสใบด่างจุ ดวงแหวนในมะละกอที่ระบาดในประเทศไทย (papaya ringspot virus, PRSV) เพื่อใช้ในการศึกษา ไวรัสนี้ในระดับโมเลกุล คณะผู้วิจัยได้พัฒนาวิธีในการสกัด genomic RNA ของ PRSV type P และ type W และใช้ เทคนิค RT PCR ในการเพิ่มจำนวน cDNA ทางปลายด้าน 5' และ 3' ของ PRSV ทั้ง 2 ชนิด โดย ใช้ข้อมูลลำดับเบสที่อนุรักษ์ของ PRSV สายพันธุ์ Hawaii และ Taiwan จากฐานข้อมูลในการออก แบบ primers ที่จำเพาะเพื่อเพิ่มจำนวนชิ้นดีเอ็นเอทางด้านปลาย 5' และ 3' ของ PRSV ที่ระบาดใน ประเทศไทย ทำการศึกษาลำดับเบสของชิ้น cDNA ที่ได้ และออกแบบ primers ชุดที่สอง เพื่อใช้ใน การเพิ่มจำนวน cDNA ทางด้านปลายสุดด้าน 5' และ 3' โดยใช้เทคนิค RACE-PCR ทำการ clone ชิ้น cDNA ที่ได้และศึกษาลำดับเบสด้านปลายสุดด้าน 5' และ 3' ของ PRSV ทั้ง 2 ชนิด เพื่อออก แบบ primers ในการเพิ่มจำนวน full length cDNA ของ PRSV โดยวิธี long and accurate PCR technique และวิธี megaprimer โดยใช้เอนไซม์ Expand Reverse Transcriptase และ Expand Long Template System (Roche) สามารถทำการเพิ่มจำนวน full length cDNA ของ PRSV ทั้ง 2 ชนิดได้ แต่พบว่าไม่สามารถ clone ชิ้น full length cDNA ของ PRSV เข้าในพลาสมิดพาหะได้ จึง ได้ศึกษาจุดตัดด้วย restriction enzyme บน full length cDNA ของ PRSV และเลือกใช้เอนไซม์ที่ เหมาะสมในการตัดแบ่ง full length cDNA ของ PRSV type W ออกเป็น 3 ชิ้นย่อย ทำการ clone แต่ละชิ้นย่อยเข้าไปในพลาสมิดพาหะ แล้วนำแต่ละชิ้นย่อยมาเชื่อมต่อเป็น full length cDNA แต่ สำหรับ PRSV type P ต้องออกแบบ primers เพื่อทำการเพิ่มจำนวนชิ้นดีเอ็นเอย่อยจาก viral RNAโดยวิธี RT-PCR ก่อน จึงทำการ clone ชิ้นดีเอ็นเอย่อยเข้าพลาสมิดพาหะ pUC19 แล้วทำการ เชื่อมต่อชิ้นดีเอ็นเอย่อยเพื่อให้ได้ full length cDNA ของ PRSV type P ทำการตรวจสอบพลาสมิด ลูกผสมที่ได้โดยใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะ และตรวจสอบจุดที่เชื่อมต่อด้วยการศึกษาลำดับเบส ขณะนี้การทดลองอยู่ในระหว่างการเชื่อมต่อชิ้นดีเอ็นเอย่อยจากแต่ละพลาสมิดเพื่อให้ได้ full length cDNA เพื่อจะนำไป subcloned เข้าพลาสมิดที่สามารถสร้าง infectious transcripts ได้ และ subcloned เข้าพลาสมิดที่สามารถควบคุมการแสดงออกของยีนในพืชได้โดยใช้ 35S promoter เป็นตัวควบคุมต่อไป The aim of this project is to generate full length infectious RNA transcript of papaya ringspot virus (PRSV), which is the key step to further study this virus on molecular level. An efficient technique to obtain high yield of genomic RNA from papaya ringspot virus (PRSV) particles type P and W was developed. The cDNA fragments near the 5’ and 3’ end of both PRSV strains were first amplified using RT PCR technique with primers derived from sequences of PRSV isolated from Hawaii and Taiwan. After sequencing, core primers based on this known sequence were designed and used to amplify the PRSV genome at the most 5’ and 3’ end regions by RACE-PCR technique. The amplified DNA fragments were cloned and sequenced. The knowledge of exact sequence of both ends of Thai PRSV allowed us design specific primers to amplify the full length cDNA of the PRSV; both type P and W, by long and accurate PCR technique using Expand Reverse Transcriptase and Expand Long Template PCR System (Roche). Both megaprimer technique and amplification with long PCR primers was developed. Altghough a relatively high amount of the full length was obtained in both type P and W isolates, it proved to be impossible to directly clone the amplified full length cDNA into a plasmid vector. Extensive restriction enzyme mapping of the amplified full length fragment was performed. The full length fragment was then either splitted into 3 parts by cutting at the unique restriction enzyme sites and/or amplified again from the original RNA by RT PCR. Resulting fragments were cloned into modified pUC19 vector and the presence of the desired clone was confirmed by restriction enzyme analysis and sequencing. The separately cloned fragments were then combined to obtain the full length clone of PRSV. The ligation junctions were confirmed by sequencing. The full length cDNA clones will be further subcloned into bacterial transcriptional cassettes to obtain infectious transcripts and into plant expressin cassette under control of 35S promoter. The unique vectors for generating the in vitro transcript of PRSV using T7 promoter and for infection by direct transcription of RNA under CaMV 35S promoter were also constructed. These experiments are now in progress.