ปฏิกิริยาลูกโซ่เอ็นไซม์โพลิเมอเรส (พีซีอาร์) เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูงในการนำมาใช้ตรวจหาดีเอ็นเอ ที่จำเพาะและนำมาช่วยในการวินิจฉัยโรคติดเชื้อหลายชนิด วิธีนี้เป็นการเพิ่มจำนวนชิ้นของดีเอ็นเอในหลอดทดลอง จากนั้นจึงทำการตรวจสอบดีเอ็นเอที่เพิ่มจำนวนขึ้น ด้วย วิธีอีเล็คโตรฟอริซีสบนวุ้น แล้วย้อมสีเอ็ทธิเดียมโบร์ไมด์ งานวิจัยนี้เป็นการศึกษา วิธีตรวจหาดีเอ็นเอของเชื้อรา ที่ก่อโรค กับอวัยวะภายในที่พบได้ในประเทศไทย คือ Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Penicillium marneffei และ Pythium insidiosum โดยใช้วิธีพีซีอาร์ งานวิจัยเริ่มตั้งแต่ออกแบบดีเอ็นเอ ต้นแบบเพื่อใช้สำหรับจับกับสายดีเอ็นเอของเชื้อที่จะใช้ ทดสอบ โดยอาศัยข้อมูลของยีน 18S rRNA จากธนาคารดีเอ็นเอ ในขั้นแรกได้ออกแบบดีเอ็นเอต้นแบบ CPL1-CPR2 เพื่อใช้ สำหรับเพิ่มดีเอ็นเอของเชื้อรา ได้ผลผลิตขนาด 606 เบส ต่อมาได้ทำการออกแบบดีเอ็นเอต้นแบบเพิ่มเติมอีกหลายชิ้น เพื่อใช้แยกเชื้อราชนิดต่าง ๆ ออกจากกัน โดยในการออกแบบนี้ ใช้ข้อมูลที่มีในธนาคารดีเอ็นเอซึ่งเรียกมาจากฐานข้อมูล Entrez release 11 ใช้โปรแกรม Macvector 4.1.4 ดีเอ็นเอ ต้นแบบคู่ที่ออกแบบให้มีความจำเพาะต่อ A. fumigatus คือ CPL1-CPR5 ผลผลิต 234 เบส ต่อ C. albicans คือ CPL3-CPR2 ได้ดีเอ็นเอผลผลิต 386 เบส ต่อ C. neoformans คือ CPL1-CPR4 ได้ดีเอ็นเอผลผลิต 343 เบส และต่อ H. capsulatum คือ CPL1-CPR6 ได้ดีเอ็นเอผลผลิต 270 เบส การศึกษาและทดสอบ ดีเอ็นเอต้นแบบต่าง ๆ ดังกล่าว กับดีเอ็นเอของเชื้อที่จำเพาะ ต่อกันนั้น มีการศึกษาและดัดแปลงวิธีการตรวจสอบโดยขบวนการ พีซีอาร์หลายขั้นตอน เช่น อุณหภูมิที่ทำให้ดีเอ็นเอจับคู่กัน เวลา ที่ใช้สำหรับให้ดีเอ็นเอจับคู่กัน จำนวนรอบที่ใช้ในการ เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอ จนกระทั่งได้วิธีการที่เหมาะสมสำหรับ ดีเอ็นเอต้นแบบแต่ละคู่ โดยนำมาทำการทดสอบกับเชื้อรา ต่าง ๆ 22 สกุล (97 สายพันธุ์) แบคทีเรีย 10 สกุล (10 สายพันธุ์) และดีเอ็นเอจากคน 1 ตัวอย่าง พบว่า CPL1-CPR5 สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอได้ผลผลิตที่จำเพาะ ของ Aspergillus sp. 9 สายพันธุ์ CPL3-CPR2 สามารถ เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอ และได้ผลผลิตจำเพาะกับ Candida sp. 23 สายพันธุ์ CPL1-CPR4 สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอของ C. neoformans 30 สายพันธุ์ และยีสต์สายพันธุ์ใกล้ชิด อีก 1 สายพันธุ์คือ Trichosporon sp. ซึ่งเมื่อทำการ ตรวจสอบโดยวิธี hybridization กับ probe (INSR 4) ที่จำเพาะ พบว่ามีความจำเพาะต่อ C. neoformans เท่านั้น CPL1-CPR6 สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอของเชื้อราได้ 3 สกุล (15 สายพันธุ์) คือ H. capsulatum (5 สายพันธุ์) Basidiobolus ranarum (1 สายพันธุ์) และ Aspergillus sp. (9 สายพันธุ์) สำหรับเชื้อ P. marneffei และ P. insidiosum นั้น ในฐานข้อมูลของยีน 18S rRNA จาก ธนาคารดีเอ็นเอยังไม่มีการบันทึกลำดับเบสไว้ จึงได้ทำการ เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอของเชื้อราดังกล่าว โดยใช้ดีเอ็นเอ ต้นแบบคู่ที่เหมาะสมกับเชื้อราทั้งหมด (CPL1-CPR2) และ นำดีเอ็นเอผลผลิตที่ได้ซึ่งมีขนาด 606 เบส มาใส่ในยีน พาหะ จากนั้นนำเข้าสู่เซลล์ Escherichia coli เพิ่ม ปริมาณยีนพาหะโดยการเลี้ยงเซลล์ E. coli ให้มีปริมาณ มากพอ แล้วจึงสกัดยีนพาหะที่มีดีเอ็นเอผลผลิต 606 เบส สอดแทรกอยู่ด้วยนี้มาทำการหาลำดับเบส เพื่อใช้ประโยชน์ ในการออกแบบดีเอ็นเอต้นแบบเพื่อใช้ในการตรวจหาและ วินิจฉัยชนิดของเชื้อต่อโรคทั้งสองชนิดโดยวิธีพีซีอาร์ ต่อไป ได้ทดลองใช้ดีเอ็นเอต้นแบบ CPL1-CPR4 ทดสอบกับ สิ่งส่งตรวจซึ่งเป็นน้ำไขสันหลังของผู้ป่วยเยื่อหุ้มสมอง อักเสบ จำนวน 49 ตัวอย่าง พบว่าน้ำไขสันหลัง 24 ตัวอย่าง ที่เพาะแยกเชื้อ C. neoformans ได้ จะสามารถตรวจพบ โดยวิธีพีซีอาร์ได้เช่นกัน แต่ใช้เวลาที่รวดเร็วกว่า คือ ใช้เวลา 4 ชั่วโมงแทนที่จะเป็น 2-3 วัน และอีก 25 ตัวอย่าง ตรวจไม่พบเชื้อใด ๆ จากการเพาะเลี้ยงบนอาหาร นำไข สันหลัง 12 ตัวอย่างซึ่งให้ผลลบต่อการตรวจหา C. neoformans จากทั้ง 3 วิธีที่ศึกษาจะให้ผลลบต่อวิธีพีซีอาร์ ส่วนน้ำ ไขสันหลังอีก 13 ตัวอย่าง ตรวจพบโดยวิธีพีซีอาร์ 6 ตัวอย่าง โดยวิธี India ink 12 ตัวอย่าง และตรวจพบโดย latex agglutination ทั้ง 13 ตัวอย่าง นอกจากนี้เพื่อต้องการ ทราบปริมาณเซลล์ของ C. neoformans น้อยที่สุดที่สามารถ ตรวจพบได้โดยวิธีพีซีอาร์ จึงศึกษาการใช้เซลล์ของ C. neoformans ปริมาณต่าง ๆ กันใส่ลงในน้ำไขสันหลัง ที่ตรวจแล้วว่าไม่มีเชื้อใด ๆ พบว่าปริมาณเชื้อ 5 เซลล์ ในน้ำไขสันหลัง 1 มิลลิลิตร สามารถตรวจพบได้โดยวิธี พีซีอาร์ จากการศึกษานี้สรุปว่าวิธีพีซีอาร์สามารถนำมาใช้ ตรวจและวินิจฉัยเชื้อราก่อโรคที่อวัยวะภายในที่สำคัญ คือ C. neoformans จากน้ำไขสันหลังของผู้ป่วยโดยตรง โดยใช้ดีเอ็นเอต้นแบบและวิธีการที่ได้พัฒนาขึ้นได้ผลดี เมื่อเทียบกับการเพาะเชื้อทั้งในด้านความไวและความ จำเพาะ แต่ได้ผลในด้านความไวต่ำกว่าการตรวจหาเซลล์ โดยวิธี India ink และตรวจหาแอนติเจนโดยวิธี latex agglutination ส่วนเชื้อ A. fumigatus, C. albicans และ H. capsulatum แม้จะยังไม่ได้ศึกษากับสิ่งส่งตรวจ แต่ ดีเอ็นเอต้นแบบที่ได้ออกแบบไว้มีความจำเพาะสูง ส่วนผลใน การตรวจวินิจฉัยกับสิ่งส่งตรวจจำเป็นต้องมีการศึกษาทดลอง ต่อไป สำหรับ nucleotide sequences ขนาด 606 เบส ของ P. marneffei และ P. insidiosum ที่ศึกษาในครั้ง นี้นับว่าได้ข้อมูลใหม่เกี่ยวกับการเรียงลำดับนิวคลีโอไทด์ ของยีน 18S rRNA ของเชื้อทั้งสองที่มีการรายงานเป็น ครั้งแรก ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการนำมาใช้ออกแบบดีเอ็นเอ ต้นแบบที่เหมาะสมต่อไป