งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ 1. เพื่อค้นหาเป็บไทด์ของโปรตีน ESAT-6 และโปรตีน CFP-10 ที่ กระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ดี เพื่อนำมาใช้เป็นองค์ประกอบของน้ำยาทดสอบผิวหนังและน้ำยาทดสอบทาง ห้องปฏิบัติการเพื่อช่วยวินิจฉัยแยกโรคการติดเชื้อวัณโรคจากการติดเชื้อมัยโคแบคทีเรียอื่นๆ 2. เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน (การผลิต interferon-gamma และ การ ผลิต antibody) ต่อโปรตีน ESAT-6 และ โปรตีน CFP-10 กับระยะของโรค (activity of disease) ในผู้ป่วยวัณโรค เพื่อพัฒนาชุดทดสอบช่วยวินิจฉัยแยกโรคระหว่างวัณโรคระยะกำเริบ กับวัณโรค ระยะสงบ 3. เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทางน้ำเหลือง (การผลิต antibody) ต่อโปรตีน ESAT-6 และ โปรตีน CFP-10 เพื่อวินิจฉัยแยกโรคการติดเชื้อวัณโรคจาก การติดเชื้อมัยโคแบคทีเรียอื่นๆ 4. เพื่อศึกษาการตอบสนองของ antibody ในน้ำช่องปอด ในการ วินิจฉัยแยกผู้ป่วยวัณโรคปอดจากผู้ป่วยโรคปอดอื่นๆ 5. เพื่อค้นหาผู้สัมผัสโรคที่เป็นกลุ่มเสี่ยงต่อ การเกิดเป็นวัณโรคในภายหลัง เพื่อผู้สัมผัสโรคกลุ่มนี้จะได้รับการเฝ้าระวังอย่างใกล้ชิด หรือได้รับ ยาป้องกันการเกิดโรค วิธีการวิจัย 1. ทำการทดสอบการตอบสนองของ IFN-γ ต่อเป็บไทด์ของโปรตีน ESAT-6 และ CFP-10 ในผู้ป่วยวัณโรคระยะกำเริบและผู้ติดเชื้อวัณโรคระยะสอบเพื่อหาเป็บไทด์ที่กระตุ้นการ ตอบสนองที่ดี 2. ทำการทดสอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันชนิดพึ่งเซลล์ (Cell-mediated immunity, CMI) ต่อโปรตีน ESAT-6 และ CFP-10 โดยเทคนิค Proliferation Assay และ IFN-γ ELISA ในผู้ป่วยวัณโรคระยะกำเริบ (active) ที่มีผลการตรวจเสมหะเป็นบวก และลบ และผู้ป่วย วัณโรคระยะสงบ (inactive) ผู้ป่วยโรคเรื้อน ผู้ป่วยติดเชื้อมัยโคแบคทีเรียอื่นๆ และผู้สัมผัสโรค 3. ทำการทดสอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทางน้ำเหลือง (antibody) ต่อโปรตีน ESAT-6 และ โปรตีน CFP-10 ในผู้ป่วยติดเชื้อและไม่ติดเชื้อ HIV ที่เป็นวัณโรคระยะต่างๆ และที่ติดเชื้อ non- tuberculous mycobacteria โดยเทคนิค ELISA 4. ทำการทดสอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ทางน้ำเหลือง(antibody) ในน้ำช่องปอดของผู้ป่วยวัณโรคและไม่ใช่วัณโรคต่อโปรตีน ESAT-6 และ โปรตีน CFP-10 โดยเทคนิค ELISA 5. ติดตามผู้สัมผัสโรคที่มีผลการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อ โปรตีน ESAT-6 และโปรตีน CFP-10 เหมือนผู้ป่วยโรควัณโรค เพื่อดูการกลายเป็นวัณโรคภายใน ระยะเวลา 2 ปี ผลวิจัย 1. เป็บไทด์ที่กระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ดีในผู้ป่วยวัณโรคระยะกำเริบและผู้ สัมผัสโรค (ผู้ติดเชื้อวัณโรคระยะสอบ) คือ 5 เป็บไทด์ จาก ESAT-6 (p1-16, 9-24, p17-32, 57-72 และ p81-96) และ 3 เป็บไทด์ จาก CFP-10 (p13-28, p55-72 และ p75-92) จำนวนผู้ป่วยและผู้ สัมผัสโรคที่ตอบสนองต่อส่วนผสมของเป็บไทด์ (Peptide muitures) ของ ESAT-6 และ CFP-10 มี ค่าใกล้เคียงกับจำนวนผู้ตอบสนองต่อ ESAT-6 recombinant protein แต่มากกว่า individual peptide เพื่อผลการตอบสนองเปรียบเทียบ mixtures,***, individual 2. พบมีการตอบสนองของ IFN-γ ต่อโปรตีน ESAT-6 และโปรตีน CFP-10 ในผู้ป่วยวัณโรคระยะกำเริบ ในระยะการ เพาะเลี้ยงเซลทั้งที่ 24 ชั่วโมง และ 6 วัน แต่ไม่พบการตอบสนองที่ 24 ชั่วโมง ในผู้สัมผัสโรค แต่ยัง พบการตอบสนองที่ 6 วัน ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการช่วยวินิจฉัยวัณโรคระยะกำเริบจากระยะสอบ 3. พบว่าการตอบสนองของ antibody ต่อโปรตีน ESAT-6 และโปรตีน CFP-10 ในผู้ป่วยติดเชื้อ HIV ที่เป็นวัณโรคประเภทต่างๆในสัดส่วนที่ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ เป็นที่ น่าสนใจว่าไม่พบการตอบสนองต่อโปรตีนทั้ง 2 ในผู้ป่วยติดเชื้อมัยโคแบคทีเรียอื่นๆ ซึ่งแสดงถึง ความจำเพาะของโปรตีนทั้ง 2 ชนิดนี้ ต่อการติดเชื้อวัณโรค และ ประโยชน์ของการนำโปรตีนทั้ง 2 ชนิดมาพัฒนาเป็นชุดทดสอบทางน้ำเหลืองเพื่อช่วยการวินิจฉัยแยกวัณโรคจากการติดเชื้อมัยโค แบคทีเรียอื่นๆ 4.พบมีการตอบสนองของ antibody ต่อ โปรตีน ESAT-6 และโปรตีน CFP-10 ใน น้ำช่องปอดในผู้ป่วยวัณโรคโดยมีความไวร้อยละ 63.6 และ 54.5 ตามลำดับ และความจำเพาะ ร้อยละ70.4 และ 81.5 ตามลำดับ 5. ในกลุ่มผู้สัมผัสโรค ........ คน มี ....... คน ( ......% ) ที่มีการ ตอบสนองของ IFN-γ ต่อโปรตีน ESAT-6 และโปรตีน CFP-10 ที่ 24 ชั่วโมงและ 6 วัน Fast and accurate diagnosis of tuberculosis is a very important element of global measure to control the disease. Current diagnostic tests for tuberculosis based on tuberculin have relatively poor specificity. Early secreted antigenic target 6 kDa protein (ESAT-6) and culture filtrate protein (CFP-10) are antigens of interest because they are expressed by M.tuberculosis but absent from M. bovis bacilli Calmette-Guerin (BCG) and most environmental mycobacteria. However, recently the homologues of these two proteins were identified in M.leprae. Thus, this study aims to identify the Mycobacterium tuberculosis-specific immunogenic peptides for the development of a species-specific skin test or IFN-γ blood tests for diagnosis of active tuberculosis and latent infection. The objectives of this preliminary study were 1) to identify the permissive Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and CFP-10 peptides 2) to compare the pattern of T cell recognition between active and latent tuberculosis and 3) to compare the T cell responses between to individual peptides, peptide mixtures and recombinant proteins. Peripheral blood mononuclear cells from 22 active tuberculosis patients and 19 healthy tuberculosis contacts with positive tuberculin reactions were tested for stimulation with 11 peptides from M.tuberculosis ESAT-6 protein and 5 peptides from M.tb CFP-10 protein, ESAT-6 peptide mixtures, CFP-10 peptide mixtures and ESAT-6 recombinant protein using the lymphocyte proliferation assay and IFN-γ ELISA assay. The results showed that five peptides (p1-16, 9-24, p17-32, 57-72 and p80-95) from ESAT-6 and 3 peptides from CFP-10 (p13-28, p55-72 and p75-92) were identified to be permissive in both active tuberculosis patients and latent tuberculosis infected subjects. The frequency of lymphoproliferative and IFN-γ responses to ESAT-6 peptide mixtures were comparable to the ESAT-6 recombinant protein but higher than individual peptides. The application of the mixture of individual permissive peptides in combination with easily read-out systems like skin tests and IFN-γ ELISA assays could benefit the epidemiological estimation of the numbers of humans exposed to the tubercle bacilli. However, the differentiation between active and latent tuberculosis and confirmation of species-specificity of the identified permissive peptides require further evaluation.