วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2551

โคลนยีนเดกซ์แทรนเนสจากรา Penicillium pinophilum SMCU 3-14 และนำไปแสดงออกในแบคทีเรียและยีสต์ โดยการแสดงออกในแบคทีเรียมีการเชื่อมต่อกับกรดอะมิโนฮิสทิดีน 6 หมู่ด้านปลายคาร์บอกซีของสายพอลิเพปไทด์ จากนั้นนำไปแสดงออกใน Escherichia coli 2 สายพันธุ์ ได้แก่ BL21(DE3)pLysS และ Rosetta-gami B(DE3)pLysS ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ T7 อีกทั้งยังได้เปรียบเทียบผลของ signal peptide จากราที่มีต่อการแสดงออกในแบคทีเรียสายพันธุ์ดังกล่าว พบว่าเมื่อเปรียบเทียบการเกิดบริเวณใสรอบโคโลนีเมื่อเลี้ยงบนอาหารแข็งที่มีเดกซ์แทรนเกรดอุตสาหกรรม 1% สายพันธุ์ Rosetta-gami B(DE3)pLysS สามารถผลิตเดกซ์แทรนเนสได้มากกว่าสายพันธุ์ BL21(DE3)pLysS และโคลนที่แสดงออกเดกซ์แทรนเนสที่มี signal peptide จากราผลิตเอนไซม์ได้มากกว่าโคลนที่แสดงออกเดกซ์แทรนเนสที่ไม่มี signal peptide ดังนั้นจึงเลือก E. coli สายพันธุ์ Rosetta-gami B(DE3)pLysS ที่แสดงออกเดกซ์แทรน เนสที่มี signal peptide จากราไปหาภาวะที่เหมาะสมในการเลี้ยงเชื้อเพื่อผลิตเดกซ์แทรนเนสในอาหาร minimal medium ที่ให้ผลผลิตสูงที่สุดโดยการวิเคราะห์ผลด้วย SDS-PAGE จากผลการทดลองสรุปได้ว่าภาวะที่เหมาะสมสำหรับผลิตรีคอมบิแนนท์เดกซ์แทรนเนสใน E. coli สายพันธุ์ Rosetta-gami B(DE3)pLysS คือ ที่อุณหภูมิ 37℃ ความเข้มข้น IPTG 25 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากการทดสอบแอกทิวิตีของรีคอมบิแนนท์เดกซ์แทรนเนสโดยวิธี Blue dextran SDS-PAGE พบว่าหลังจากรีเนเจอร์แล้วเดกซ์แทรนเนสที่ผลิตได้ สามารถย่อยบลูเดกซ์แทรนและเกิดบริเวณใสบนเจลได้ และเมื่อนำรีคอมบิแนนท์เดกซ์แทรนเนสที่ผลิตได้ไปทำให้บริสุทธิ์ โดยโครมาโทกราฟีสัมพรรคภาพ พบว่าเดกซ์แทรนเนสที่ได้มีขนาดประมาณ 68 กิโลดาลตัน สำหรับการแสดงออกในยีสต์ พบว่าเมื่อนำเดกซ์แทรนเนสไปแสดงออกใน Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์ BJ5462 ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ PGK ที่ควบคุมให้มีการแสดงออกตลอดเวลาแล้ว ยีสต์ดังกล่าวสามารถผลิตเดกซ์แทรนเนสและหลั่งออกมาในอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยเดกซ์แทรนเนส ดังกล่าวสามารถย่อยเดกซ์แทรนได้