วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย,2552

Notch3 เป็นโพรโทอองโคยีน (protooncogene) ซึ่งมีหน้าที่ควบคุมการเจริญ การแปรสภาพเพื่อทำหน้าที่เฉพาะและกระบวนการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซีส ในระบบภูมิคุ้มกัน Notch3 ควบคุมการพัฒนาของ regulatory T cell และกระบวนการแปรสภาพเพื่อไปทำหน้าที่เฉพาะของ helper T cell ความผิดปกติของ Notch3 มีความสัมพันธ์กับการเกิดมะเร็งและโรคในระบบประสาท งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อเอคโตโดเมนของ Notch3 โดยทำการออกแบบไพร์เมอร์เพื่อสร้างตำแหน่งตัดของเอนไซม์ตัดจำเพาะภายในเอคโตโดเมนของยีน mNotch3 ที่บริเวณ EGF repeats 9-14 ภายหลังจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะทำการเชื่อมต่อชิ้นยีน mNotch3 กับเวกเตอร์ pET-15b ซึ่งมีส่วนของฮีสติ ดีนแทกแทรกอยู่ที่ปลายทางด้าน 5’ จากนั้นนำรีคอมบิแนนท์พลาสมิดไปแสดงออกในเซลล์เจ้าบ้านแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) pLyS และ Rosetta gami B (DE3) pLyS ภายหลังการชักนำพบว่า E. coli สายพันธุ์ Rosetta gami B (DE3) pLyS สามารถผลิตโปรตีน mNotch3 ได้โปรตีนขนาดประมาณ 33 kDa จึงคัดเลือก E. coli สายพันธุ์นี้ในการหาภาวะที่เหมาะสมเพื่อผลิตโปรตีน mNotch3 ให้ได้มากที่สุด จากผลการทดลองพบว่าภาวะที่เหมาะสมในการผลิตโปรตีน mNotch3 คือที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ชักนำด้วย IPTG ที่ความเข้มข้น 0.3 มิลลิโมลาร์ ที่ค่าการดูดกลืนแสง 600 นาโนเมตรเท่ากับ 0.2-0.8 นาน 6 ชั่วโมง ทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ด้วยชุดน้ำยาสำเร็จรูป His-Select Nickel beads column affinity โปรตีน mNotch3 บริสุทธิ์ใช้เป็นแอนติเจนสำหรับกระตุ้นภูมิคุ้มกันในหนูไมซ์สายพันธุ์ BALB/c เพื่อผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี ภายหลังจากการหลอมรวมเซลล์ม้ามกับเซลล์มัยอีโลมานำอาหารเลี้ยงเซลล์มาทดสอบการสร้างแอนติบอดีด้วยเทคนิค Western blot พบว่าได้เซลล์ไฮบริโดมาที่ผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีทั้งหมด 4 โคลน ได้แก่ 4/D8-D6, 2/D5-F6, 2/D5-G6 และ 2/D5-E2 และเมื่อทดสอบความสามารถของโมโนโคลนอลแอนติบอดีในการจับ mNotch3 ที่แสดงออกบนผิวของเซลล์ 293T ที่มีบริเวณเอคโตโดเมนของ mNotch3 ด้วยเทคนิค Cell ELISA พบว่าโมโนโคลนอลแอนติบอดีรหัสโคลน 4/D8-D6 และ 2/D5-F6 มีความจำเพาะต่อรีเซบเตอร์ที่ผิว ซึ่งโมโนโคลนอลแอนติบอดีเหล่านี้สามารถใช้ประโยชน์ในการศึกษาการแสดงออกของ Notch3 ในเซลล์และเนื้อเยื่อต่อไป